大肠癌患者骨髓微转移的基因研究

中华外科杂志 2000年第3期第38卷 临床研究

作者：李世拥　骆成玉　于波　苑树俊　梁振家

单位：100700 北京军区总医院普通外科

关键词：大肠肿瘤；肿瘤转移；骨髓；突变；基因

　　摘　要：目的　探讨大肠癌患者骨髓中微转移基因检测的意义。　方法　应用聚合酶链式反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)/银染技术，检测51例大肠癌患者手术前、后不同时间骨髓中p53和K-ras基因的突变状况。　结果　51例患者术前骨髓中基因突变阳性者19例，阳性率37.25%。阳性检出与Duke′s分期、淋巴转移显著相关。术后经2～3个疗程的化疗后，19例基因突变阳性的患者中11例转阴。　结论　大肠癌患者骨髓转移癌细胞的基因检测，有助于大肠癌血路转移的早期诊断，对判断肿瘤恶性程度和患者预后并指导术后辅助治疗方案的选择有重要意义。

Genes of micrometastasis in bone marrow of patients with colorectal cancer

LI Shiyong， LUO Chengyu, YU Bo

　　（Department　of General Surgery, Beijing General Hospital, People′s Leberation Army, Beijing 100700,China.）

　　Abstract：Objective　To detect the gene of micrometastasis in bone marrow of patients with colorectal cancer.　Methods　PCR-SSCP/silver stain technique was used to find out the metastatic cancer cells in 51 bone marrow samples in different time.　Results　The total positive rate of mutations of p53 and K-ras in bone marrow was 37.25% before operation. The incidence of mutations was obviously correlated with Duke′s stage and lymphatic metastasis. After postoperative chemotherapy mutation in 11 patients turned to be negative.　Conclusions　Detection of micrometastasis in bone marrow may contribute to early diagnosis of blood stream metastasis of colorectal cancer.

　　Key words：Colorectal neoplasm；　Neoplasm metastasis；　Bone marrow；　Mutation；　Gene

　　大肠癌治疗失败的主要原因在于癌肿的转移和复发,这部分患者可能在治疗前或治疗时就已有癌细胞播散到其它部位，成为转移复发的根源，然而常规检查方法难以发现。血行转移是大肠癌的一种主要转移途径。因此，血流丰富的骨髓易发生癌细胞转移^［1］。本研究应用聚合酶链式反应-单链构象多态性分析（PCR-SSCP）/银染技术，对51例大肠癌患者骨髓中p53和K-ras基因的突变状况进行了检测，以确定是否存在微转移癌细胞。

　　资料与方法

　　1．临床资料：大肠癌患者51例,其中男32例，女19例；平均年龄57.6岁；均经病理证实，行手术治疗。病理分型：高分化腺癌15例，中分化腺癌25例，低分化癌11例。Duke′s分期：A期7例，B期15例，C期20例，D期9例。有淋巴结转移者29例，无淋巴结转移22例。术后接受2～3个疗程的正规化疗（表阿霉素、丝裂霉素和喃呋啶三联）。在术前和术后不同时间于局麻下从髂后上棘穿刺分别抽取骨髓5～10 ml，加肝素抗凝，置于淋巴细胞分离液中经Ficoll梯度离心分离出有核细胞。

　　2．检测方法:基因组DNA提取按常规酚-氯仿-异戊醇抽取基因组DNA^［2］,TE溶解,测波长为260及280紫外光下的OD值,进行定量,4 ℃存放备用。引物合成参照文献［3，4］的基因序列，合成p53外显子5、6、7、8、9及K-ras密码子12和61的相应引物。PCR-SSCP/银染根据我们的改进方法进行^［3］。

　　3．随访时间：术后患者随访6.0～32.0个月。

　　4．统计学分析：采用χ²或Fisher检验。

　　结果

　　本组51例大肠癌患者中，术前骨髓p53和K-ras突变基因的分布状况见表1。14例p53基因突变的患者中，3例为第5外显子突变，1例为第6外显子，5例为第7外显子，3例为第8外显子，2例为第9外显子；10例K-ras 基因突变的患者中，7例为第12密码子，3例为第61密码子。本组患者骨髓中p53和K-ras基因突变状况与临床病理间的关系见表2。

表1　大肠癌患者p53和K-ras突变基因的分布状况

表2　大肠癌患者p53和K-ras基因突变状况与病理因素的关系

　　术后随访结果：本组患者经2～3个疗程的化疗后，19例骨髓基因突变阳性的患者中11例转阴，转阴率为57.89%。后续中位随访时间14.0个月（6.0～32.0个月），5例患者出现复发转移。其中1例为术后突变基因转阴者，在术后18.0个月发生腹腔转移；1例为手术前后骨髓突变基因均阴性者，于术后23.0个月出现肝转移；3例为手术前后突变基因持续阳性的患者，分别于术后5.5、7.0和9.0个月出现复发、肝脏或腹腔广泛转移。

　　讨论

　　肿瘤克隆形成过程中基因的改变早于形态的改变，所以对癌变基因及其产物的检测将有助于癌症患者的早期诊断。p53和K-ras基因在大肠癌中突变率均很高，前者的发生率约80%,后者约50%左右^［4］。因而检测大肠癌患者骨髓中p53和K-ras基因的突变情况,可早期发现骨髓中存在的微转移。

　　本组患者，手术前骨髓p53、K-ras 基因的突变检出率分别为27.45%和19.80%，两者突变率之合为47.25%。因此，对大肠癌患者骨髓微转移的诊断同时检测2种基因较检测1种基因更敏感。本研究还表明，恶性肿瘤中p53基因突变或丢失主要发生在4个进化高度保守区，即外显子5～8，大肠癌组织中p53突变率尤以第7和8外显子为高^［3，7］。本组患者骨髓中，p53突变在第7和第8外显子的机率也相对较高，表明骨髓中p53变化与癌组织中是一致的。

　　本组Duke′s A期的7例患者中，术前检出骨髓微转移1例,提示早期大肠癌就有通过血路播散的可能，对这些患者忽视术后的辅助化疗无疑会影响患者的预后。随着临床病理分期的提高，淋巴结转移的出现，骨髓微转移显著增加。说明随着病情的进展，血行播散的机会增多。因此了解骨髓微转移状况，有助于大肠癌血行转移的早期诊断，并对判断肿瘤恶性程度和患者预后及指导术后辅助治疗方案的选择都有重要意义。临床可根据大肠癌患者骨髓中癌细胞的检出结果进行针对性的辅助化疗。特别是对于Dukes A、B期的患者，化疗的针对性尤为重要。因为骨髓中检出癌细胞，表明患者已存在血液的微转移，不能再做为早期患者对待，应及时合理的辅助治疗，以降低患者术后癌肿的转移和复发率，改善预后，提高5年生存率。

　　大肠癌患者手术后，原发病灶被切除，不再有癌细胞释放入血，再通过术后的辅助化疗有效地消灭骨髓内微转移的癌细胞，必然大大降低患者转移灶的形成及病情的复发率。手术及术后辅助化疗后骨髓微转移持续存在的患者其复发或发生远处转移的可能性较大，对这类患者的严密随访检查就显得致关重要，以便早期发现复发或转移，从而早期治疗。因此，动态观察大肠癌患者骨髓内微转移为判断治疗效果和实施个体化治疗方案提供了一个较为客观的参考指标，并可作为监测患者术后早期复发或转移的一项重要参数。

　　参考文献：

　　［1］Calaluce R, Miedema BM, Yesus YW. Micrometastasis in colorectal carcinoma: a review. J Surg Oncol,1998,67:194-202.

　　［2］Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning:laboratory manuals. 2th ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.463-493.

　　［3］薛涛，祝学光，骆成玉.应用PCR-SSCP银染技术检测结直肠癌p53基因突变.中华实验外科杂志，1996，13：21-22.

　　［4］Ilyas M, Tomlison IP.Genetic pathways in colorectal cancer. Histopathology,1996,28:389-394.

　　［5］Bos JL. Ras oncogenes in human cancer:a review.Cancer Res,1989,49:4682-4689.

　　［6］Kikuchi-Yanoskita R, Konishi M, Ito S, et al.Genetic changes of both p53 alleles associated with conversion from colorectal adenoma to early carcinoma in familial adenomatous polyposis and non-familial adenomatous polyposis patients.Cancer Res,1992,52:3965-3971.

　　［7］李世拥，于波，安萍，等.胆汁中突变基因与大肠癌肝转移关系的研究.中华外科杂志，1999，37：106-109.

收稿日期：1999-05-25