端粒酶反义寡核苷酸对二甲肼诱导大鼠大肠癌的预防作用

癌症 1999年第6期第19卷 基础研究

作者：吴成秋，陈雯，张桥，吴大伟，魏青，万德森

单位：吴成秋，陈雯，张桥，吴大伟，魏青　中山医科大学公共卫生学院卫生毒理学教研室(广州,510089)；万德森　中山医科大学肿瘤防治中心

关键词：二甲肼；大肠肿瘤；端粒酶反义寡核苷酸；保护作用；大鼠

　　【摘要】目的：探讨端粒酶反义寡核苷酸对二甲肼诱导大鼠大肠癌的预防作用。方法：用1，2-二甲肼(1，2-DMH)诱导SD大鼠肠癌发生的模型，观察端粒酶反义寡核苷酸对端粒酶活性及二甲肼诱癌率的影响。结果：本研究使用二甲肼成功地诱导了大鼠大肠癌发生模型，阴性对照组未见肿瘤发生，阳性诱癌组诱癌率为57.69％，反义寡核苷酸保护组诱癌率为26.92％，明显低于阳性诱癌组(P＜0.01)；同时反义寡核苷酸保护组端粒酶活性低于阳性诱癌组(P＜0.05)。结论：端粒酶反义寡核苷酸在体内能抑制端粒酶活性，对DMH诱导的肠癌有预防作用，可望成为预防和治疗大肠癌的有效药物。

　　中图分类号：R739.6　　文献标识码：A　　文章编号：1000－467X(1999)06－0639－03

Prevention of antisense oligonucleotide of telomerase against

　　colon cancer in rats induced by dimethylhydrazine

WU Cheng qiu, CHEN Wen, ZHANG Qiao, et al.

　　Department of Health Toxicology,School of Public Health,

　　Sun Yat sen University of Medical Sciences,Guangzhou 510089,R.P.China

　　【Abstract】 Objective：To reveal the possibility of antisense oligonucleotide of telomerase used as an effective agent for tumor prevention.Methods：The colon carcinogenesis model induced by 1,2 dimethylhydrazine (1,2-DMH) was used to observe the effect of antisense oligonucleotide of telomerase on the inhibition of telomerase activity and the rate of colon carcinagenesis induced by 1,2-DMH.Results：The colon carcinogenesis model was successfully established in this experiment.As a result,the negative control group develop tumor.The cancer inducing rate of positive control group is 57.69％,while that of the oligonucleotide protecting group is 26.92％.The difference between the two groups is statistically significant (P＜0.01).The activity of telomerase in the olgonucleotide protecting group is lower than that of the positive group starting from 10th week of DMH administration (P＜0.05).Conclusion：The antisense oligoncleotide of telomerase can inhibit the activity of telomerase and increale the protection rat of induced colon cancer in vivo. It might be an effective agent for the prevention and treatment of colon cancer.

　　Key words：Colon cancer;Dimethylhydrazine; Antisense oligonucleotide of telomerase; Protective effect; Rats

　　肿瘤研究的一个目标是发现对所有癌细胞生长绝对需要而对正常组织细胞不需要的因子，这些因子就可能成为癌症治疗的共同靶子^[1]。端粒酶约在90％的人体肿瘤组织中高表达而在正常组织中无活性，这一事实表明端粒酶在肿瘤的发生发展中起着重要作用，是维持肿瘤细胞增殖所必需的^[2～4]。那么端粒酶可否成为癌症治疗的共同靶子呢?目前文献报道：以端粒酶为靶点的反义寡核苷酸在体外可抑制永生化细胞的端粒酶的活性及其延长细胞倍增时间，并诱发细胞死亡^[5]，在体内可延缓移植性肿瘤的生长^[6]。本文以特异性致肠癌物1，2-二甲肼诱导SD大鼠肠癌模型，观察端粒酶模板区的硫代修饰的反义寡核苷酸在诱癌过程中对端粒酶活性的影响及其对诱癌的预防作用。

　　1材料与方法

　　1.1动物与阳性细胞株

　　158只体重为90～110g的SD大鼠，雌雄各半，由广东省医用实验动物中心提供(合格证号为98A033)；人鼻咽低分化鳞癌细胞株(CNE2)由中山医科大学肿瘤研究所提供。

　　1.2主要试剂

　　1，2-二甲肼(Dimethylhydrazine，DMH)，购自美国Aldrich公司；3H-dCTP购自NENTMLifeScienceProducts公司(92.5GBq/L,比活性2.0TBq/mmol)；2，5-二苯基恶唑(PPO)和1，4-双(5-苯基-2-恶唑基)苯(POPOP)购自上海化学试剂分装厂；TS引物(5′-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3′)和CX引物(5′-CCCTTACCCTTACCCTTACCCTAA-3′)由加拿大Genda公司合成；硫代修饰的端粒酶反义寡核苷酸(5′-GTTAGGGTTAG-3′)由上海生物所合成。

　　1.3动物分组与处理

　　158只SD大鼠，随机分为3组，A组50只为对照组，按0.5ml/100g体重腹腔注射1mmol/LEDTA，每周一次；B组54只为阳性诱癌组，按25mg/kg体重腹腔注射DMH，每周一次。DMH在临用前用1mmol/LEDTA配成5mg/ml的溶液，并以1mol/LNaHCO₃调pH至6.5～7.0^[7]；C组54只为反义寡核苷酸保护组，DMH用药同B组，反义寡核苷酸从第4周起按33μg/kg体重行腹腔注射^[8]，每周一次，到第16周改用每周二次，并在处死前一周加用一次。各组动物分别于第5，10，15，20周每组处死10只，剩余动物于第23周全部处死。动物处死后立即分离全部大肠，纵向剪开，用预冷的生理盐水、PBS各漂洗一次，然后将大肠平铺在滤纸条上，观察肿瘤生长情况。其中1/2的动物分别在距离肛端1.5～3.5cm，9～11cm及距回盲部2～4cm处(有肿块或病变明显的不定位)取材约50mg装于1.5ml消毒好的离心管中，速冻于－80℃，供作端粒酶活性定量检测；另1/2的动物在上述相应的固定部位取材，按常规法制作普通病理切片，每样品至少制作三张病理间断切片。

　　1.4端粒酶活性半定量分析

　　1.4.1蛋白提取和蛋白浓度的测定：细胞或组织中端粒酶蛋白的提取分别按Kim等^[2]方法进行，蛋白质浓度测定采用考马斯亮蓝G-250法，并调整蛋白浓度为1μg/μl。

　　1.4.2端粒酶活性半定量检测：参照Kim等^[2]建立的TRAP法，稍加修改，在PCR过程中，加入3H-dCTP，扩增产物经聚丙烯凝胶电泳分离后，银染显色观察结果，然后将相应泳道切下置闪烁瓶烤干，加4ml闪烁液，进行液体闪烁计数cpm。每次PCR均设阳性对照(CNE2细胞)和阴性对照(裂解液)。端粒酶活性以cpm/1μg蛋白来表示，不同批次的结果均以阳性细胞的cpm为参比按照统一方法进行校正(详细方法《癌变·畸变·突变》1999；11(5)：213)。

　　1.5统计分析

　　采用SSPS统计软件的t检验和卡方检验比较组间差异。

　　2结果

　　2.1一般情况分析

　　加DMH前各组动物间平均体重差异无显著意义(P＞0.05)；至第8周后，B组、C组的体重低于A组，至第18周后B组的体重略有减轻，而C组的下降不明显；第23周时，C组的平均体重高于B组(P＜0.05)，说明随着反义寡核苷酸剂量的增加，对DMH的诱癌发挥了一定的预防作用。

　　2.2病理学观察

　　2.2.1肉眼观察：第5周各组动物大肠未见明显病变，至第10周后，B、C组大鼠大肠质地较硬，纵向剪开可见粘膜均有不同程度斑块增厚区。增厚区多发生在离肛门2～4cm、7～11cm、15～17cm处，肉眼观察到肿块39个，其中B组25个(18/51只鼠)，C组14个(10/52只鼠)，最早发现肿块于15周，第15、20周B、C组肿块发生情况无差别。但23周时，B组肿块发生率明显高于C组(P＜0.05)，且体积较C组的大，并有一肿块突破肠壁浸润到肠系膜，说明反义寡核苷酸的保护作用较迟，或开始因剂量较小，保护作用不明显，第16周后加大剂量才有一定的保护作用。肿块多发生在上述相应的斑块增厚区，多呈乳头菜花状生长，部分呈中心凹陷型生长。最小的肿块0.2cm×0.2cm,高出平面约0.2cm，最大者1.5cm×1.8cm，高出平面约0.8cm。

　　2.2.2显微镜检查：镜检发现B、C组于第5周开始出现非典型增生，位于粘膜上1/3。随着时间的推移，增生逐渐向下发展，增生程度逐渐加重。在第5、10周B、C组增生程度无差别，第15周出现镜下肠癌病变，主要为腺癌及混合型癌(腺癌合并粘液腺癌)。肠癌发生率及组织学分型如表1。A组未发现肠癌，B组肠癌发生率为57.69％，C组为26.92％，C组发癌率低于B组(χ²=5.04，P＜0.01)，说明端粒酶反义寡核苷酸对DMH诱癌有一定的预防作用。

表1　DMH诱发大鼠肠癌的组织类型及诱癌率

　　*C组与B组比较：差异有高度显著性χ²=0.54，P＜0.01

　　2.3端粒酶活性分析

　　正常的大鼠肠粘膜端粒酶呈弱阳性，B组、C组大鼠肠粘膜在诱癌过程中端粒酶活性均增高，但C组的端粒酶活性在诱癌的第10，15，20，23周均较B组相应时间低(P＜0.05)，且C组端粒酶活性随着反义寡核苷酸用药剂量增加，有逐渐降低的趋势(表2)。说明反义寡核苷酸对端粒酶活性有一定的抑制作用，并呈剂量-反应趋势。

表2　端粒酶反义寡核苷酸对端粒酶的抑制作用(cpm/μg蛋白，±s)

　　*与B组或C组比较：差异有高度显著性，P＜0.01。　△B组与C组比较：差异有显著性，P＜0.05。

　　3讨论

　　端粒长度被认为是细胞的有丝分裂计数器，而端粒长度的维持依赖于端粒酶的激活^[9]。正常体细胞因缺乏端粒酶的活性，在细胞分裂复制过程中，因末端复制问题的存在，而使端粒逐渐缩短。当端粒缩短到一定程度时，即不能维持染色体的稳定性，细胞最终衰老死亡。肿瘤细胞由于端粒酶的高表达维持了端粒的长度，使细胞获得永生。从理论上讲，抑制端粒酶的活性，缩短端粒将使肿瘤细胞逐渐衰老死亡。端粒酶的反义寡核苷酸技术即是针对端粒酶的模板区RNA序列而设计的一段与之互补的单股DNA，正常结构的DNA片段易被细胞内和体内大量存在的核酸酶所降解。本研究中采用硫代修饰型反义寡核苷酸。结果表明：在DMH诱导大鼠大肠癌发生模型中，端粒酶抑制剂反义寡核苷酸预防组肿瘤形成的数量少，体积小，肿瘤的发生率低于DMH诱癌组，端粒酶活性水平低于DMH诱癌组，说明反义寡核苷酸可抑制端粒酶活性，对DMH诱癌有一定的预防作用。本研究结果与Mata^[6]等研究得出的反义寡核苷酸可抑制Burkitt′s淋巴瘤细胞的端粒酶活性，延长细胞倍增时间，及抑制移植肿瘤的生长的结论相一致。在诱癌的早期阶段，反义寡核苷酸预防组与DMH诱癌组二者在细胞异型增生程度及肿瘤的形成数量上差异无显著性，说明端粒酶反义寡核苷酸对DMH诱癌的预防作用较迟。其原因可能是端粒酶的活性被抑制后，端粒短到停止细胞分裂的临界长度需要一定的时间。当然也不能排除我们最初使用剂量较小的缘故，到16周后增大了用药剂量及用药次数，才发挥其对DMH诱癌的预防作用及对已形成的肿瘤的治疗作用。Mata^[6]等发现反义寡核苷酸降低移植肿瘤大小的作用存在剂量依赖关系。本研究由于受时间限制，没有进行端粒酶反义寡核苷酸对DMH诱癌预防作用的剂量反应关系研究。我们相信随着端粒酶研究的深入及反义寡核苷酸合成技术的改进，端粒酶抑制剂反义寡核苷酸作为抗肿瘤的新药将具有广阔前景。

　　基金项目：本课题受美国中华医学会基金会(CMB)及国家自然科学基金(3967064)资助

　　〔参考文献〕

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　　〔2〕Kim NW,Piatyszek MA,Prowsa KR,et al.Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer〔J〕.Science,1994,266：2011～2015.

　　〔3〕Rhyu MS. Telomeres,telomerase,and immortality〔J〕.J Natl Cancer Inst,1995,87： 884～894.

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　　〔5〕Feng J,Funk WD,Wang SS,et al.The RNA component of human telomerase 〔J〕. Science,1995,269：1236～1241.

　　〔6〕Mata JE,Joshi SS,Palen B,et al.A hexameric phosphorothioate oligonucleotide telomerase inhibitor arrests growth of Burkitt′s lymphoma cells in vitro and in vivo 〔J〕.Toxicol Appl Pharmacol,1997,144(1)：189～197.

　　〔7〕陈锋，钟小明，杨杏芬，等.螺旋藻对二甲肼诱导SD大鼠肠癌的预防作用〔J〕.癌变·畸变·突变，1995，7(3)：134～140.

　　〔8〕李惠芳，孙桂香，卢薇薇，等.多药耐药基因反义寡核苷酸体内逆转耐药的初步研究〔J〕.中华儿科杂志，1998，36(1)：12～14.

　　〔9〕Allsopp RC,Vaziri H,Patterson C,et al.Telomere length predicts replicative capacity of human fibroblasts〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA,1992,89：10114～10118.

收稿日期：1998－12－08