Dukes’B期大肠癌淋巴结微小转移灶检测的临床研究
癌症 2000年第5期第19卷 临床研究
作者：张丽萍 鲍云华 吴进冬 李国民
单位：张丽萍(海军总医院放射肿瘤科,北京100037)；鲍云华 吴进冬 李国民(军事医学科学院附属医院病理科,北京100039)
关键词：大肠癌；免疫组化；微小转移灶；细胞角蛋白
【摘要】目的：Dukes'B期大肠癌患者手术后5年生存率为53.9％～84.9％,有部分患者5年内出现局部复发或/和远处转移。本研究旨在探讨淋巴结微小转移灶(lymph nodes micrometastasis， LMM)的表达对评估经手术切除原发肿瘤及肠周淋巴结的Dukes'B期大肠癌患者预后的重要性和指导术后治疗的意义。方法：收集52例Dukes'B期大肠癌患者手术切除的淋巴结石蜡标本,同时获得这些病例的临床资料及随访（生存期大于5年或死亡）资料；实验方法：以细胞角蛋白单抗(anti-cytokerratin AE1/AE3)为探针,采用免疫组化SAP(streptavidin-alkaline phosphatase)法检测淋巴结中的LMM。结果：测52例Dukes'B期大肠癌患者的淋巴结中LMM＋组11例(21.15％),LMM-组41例(78.85％)。在38例生存期大于5年的患者中LMM＋占13.2％(5/38,)LMM-占86.8％(33/38)。χ2检验P＜0.05,生存分析log-rank检验P＜0.05；说明LMM＋组的生存期明显短于LMM-组。本实验中一般因素(性别、年龄及肿瘤所在部位)对LMM检测结果的影响不明显；统计学处理，P＞0.05。结论：用免疫组化法检测Dukes'B期大肠癌患者经手术切除后肠周淋巴结中的微小转移灶对判断患者预后及指导术后治疗均有意义，值得在临床应用。
中图分类号：R735.34;R73-37文献标识码：A文章编号：1000－467X（2000）05－0481－04
The clinical study on lymphnodes micrometastasis of stage Dukes'B colorectal cancer
ZHANG Li-ping, BAO Yun-hua, WU Jin-dong, et al.
（Deparment of Radiooncology, Vavy General Hospital, Beijing 100037,P.R.China）
【Abstract】 Objective： Patients with Dukes'B (transmurally invasive, lymph node negative) colorectal cancer have a postoperative 5-year survival rate of about 53.9％ to 84.9％ . It means that part of the patients appears local relapse or/and distant metastasis in the period of 5 years. The object is to clinical significance of investigate the lymph node micrometastasis (LMM) for prognosis and postoperative treatment. Methods： The paraffin-embedded lymph nodes samples from 52 patients were collected. The clinical material and follow-up information the patients were obtained. The immunocytochemical staining method of streptavidin-alkaline phosphatase (SAP) was applied to detect the micrometastasis in lymph nodes using the monoclonal antibody AE1/AE3, which is specific for cytokeratin antigens. Results： Micrometastases (LMM＋ ) were detcted in 11(21.15％ ) out of 52 patients. There were 13.2％ (5/38) LMM＋ and 86.8％ (33/38) micrometastasis negative (LMM-) in 38 patients of more than 5-year survives. χ2 test,P＜0.05. Survive analysis by log- rank test, P＜ 0.05. Micrometastasis in lymph nodes was associated with decreased survival time in patients with Dukes＇B colorectal cancer. However, micrometastasis was not affaeted by of the sex, age patient and location of the carcinoma (P＞0.05). Conclusions： Micrometastases in lymph nodes in patients with Dukes'B colorectal cancer obviously influence survival time. The detection of micrometasbasis is for guiding postoperative treatment.
Key word： Dukes'B colorectal cancer; Immunohistology; Lymph nodes mirometastasis; Cytokeratin
我国的大肠癌发病率、死亡率亦呈逐年上升趋势。欲提高大肠癌的长期生存率，提高早期诊断率和准确、客观地判断预后是关键所在[1]。目前临床上广泛应用Dukes[2]分期。在此分期中，肠周淋巴结有无癌转移是其肿瘤分期、治疗及评价的重要依据[3,4]。Dukes'B期患者5年生存率各家报道在53.9％～84.9％[4],因此有人提出了隐匿的微小转移灶（直径小于2mm）这一概念[5]，只是用常规病理学方法很难检测到。近年来，随着分子生物学技术的发展和应用，尤其是细胞骨架之一细胞角蛋白(cyto-keratin,CK)[6]的深入研究，上皮系统肿瘤特异性抗体的研究日趋完善。国内外不少学者应用免疫组化法、PCR法、放射性同位素示踪法等大大提高了检测的敏感性和特异性，在大肠癌患者的标本及/或活体上证实了淋巴结中存在的微小转移灶，并因此改变了患者的分期和治疗方案及预后。对指导临床工作有重要意义。
1材料与方法
1.1病例入选条件
①均为结直肠癌经手术完整切除原发灶及肠周淋巴结清扫术后患者。传统病理检查为Dukes'B期(肿瘤穿透肌层到达浆膜下层未达到结肠周腹膜或直肠周组织;无区域淋巴结转移)。②随访时间均超过5年；最长者达10年。③死亡病例患者均死于与肿瘤有关的疾病,包括复发、转移等所致死亡的病例,而术后并发症、心梗、脑出血等所致死亡的计为无效病例。④有淋巴结及原发灶的石蜡标本。⑤LMM＋＋＋＋被认为是漏检或误诊病例,应为N1或N2而不是N0病例,计为无效病例。⑥仅有原发灶标本而无淋巴结标本的病例,因无法得知是否为LMM＋＋＋＋,计为无效病例。
本实验最终符合以上6条入选条件的病例为52例,（共检测原发灶52个，淋巴结453个）。其中男性33例,女性19例;大于60岁的37例,小于60岁的15例;肿瘤位于结肠的25例,直肠的27例;5年生存率为73.1％(38/52)。
1.2实验材料
1.2.1标本：收集到52例Dukes'B期结直肠癌手术切除的淋巴结及原发灶的石蜡包埋标本(标本来源于军事医学科学院附属医院),常规制成4μm厚石蜡切片。
1.2.2试剂：①一抗：细胞角蛋白鼠抗人单抗AE1/AE3。②SAP试剂盒：包括生物素标记的兔抗鼠IgG二抗工作液、碱性磷酸酶标记的链酶卵白素三抗工作液以及封闭用山羊血清工作液。(①②均由美国DAKO公司生产,购自北京中山生物技术有限公司)③免疫组化实验一般试剂：TBS液;TB液;枸橼酸缓冲液;10％羊血清;0.4％胃蛋白酶。④显色剂坚固红工作液。
1.3实验方法
第一天：淋巴结4μm切片55℃烘烤过夜。第二天：①将切片放入二甲苯原液3瓶,脱蜡。②梯度酒精(脱二甲苯)。③加胃酶液37℃孵育。④微波加热(抗原热修复)。⑤在②③④后均用0.05mol/LTBS液3瓶各洗5分钟。⑥加10％羊血清温箱中孵育。⑦加AE1/AE3一抗,4℃冰箱过夜。第三天：①过夜后标本用0.05mol/LTBS液3瓶各洗5分钟。②加二抗后温箱中孵育35分钟并重复①。③加三抗后温箱中孵育35分钟并重复①。④坚固红液显色25分钟左右。⑤清水涮洗后苏木素瓶内1分钟。⑥用封片胶封片。
1.4判断标准
CK抗原定位于细胞浆内,阳性细胞为玫瑰红色,阴性细胞不着色。淋巴结内发现CK标记的细胞,结合组织结构和细胞形态,确定为肿瘤微小转移灶阳性(LMM＋)。一个淋巴结内肿瘤细胞0个为－,1～5个为＋(图1a),6～25个为＋＋(图1b),26～50个为＋＋＋(图1c),51个以上为＋＋＋＋(图1d)。＋＋＋＋者考虑为漏诊,即常规病理染色应能发现的转移灶。故不能以微小转移灶计算，计为无效病例。
图1免疫组化SAP方法，坚固红染色，显示CK抗原定位
a.LMM＋,阳性细胞为玫瑰红色，数目1～5个，×200；b.LMM＋＋，阳性细胞为玫瑰红色，数目6～25个，×400
c.LMM＋＋＋，阳性细胞为玫瑰红色，数目26～50个，×400；d.LMM＋＋＋＋，阳性细胞为玫瑰红色，数目＞50个，×400
图2 LMM＋组及LMM－组生存曲线比较
1.5统计学分析
临床一般情况进行χ2检验,生存情况进行log-rank检验,并用Kaplan-Meier曲线表示。
2结果
2.152例Dukes'B期结直肠癌患者LMM检测结果
LMM＋组占21.15％(11/52);LMM-组占78.75％(41/52)。检测的453个(平均9.1个/例)淋巴结中22个(4.85％)阳性。
2.238例生存期大于5年患者LMM检测结果
LMM＋组占13.2％(5/38);LMM-组占86.8％(33/38)。χ2检验P＜0.05。
2.314例死亡患者复发或转移情况
肺转移4例;局部复发4例;肝转移3例;肺及肝转移2例;肺转移及局部复发1例。
2.4LMM对生存期的影响
检测52例Dukes'B期(肿瘤穿透肌层到达浆膜下层未达到结肠周腹膜或直肠周组织;无区域淋巴结转移)结直肠癌患者5年生存率为73.1％(38/52),淋巴结中LMM＋组11例,LMM＋组5年生存率为45.5％(5/11);LMM－组41例,LMM-组的5年生存率为78.05％(32/41)。χ2检验P＜0.05,生存分析logrank检验P＜0.05,LMM＋组的5年生存率明显小于LMM－组。表明DukesB期结直肠癌患者LMM与预后呈负相关。(见图2,生存分析经Logrank检验)。
2.5一般因素与LMM结果的关系
在本组检测的52例患者标本中性别,年龄及肿瘤所在部位与LMM结果无关(见表1)。
表1 一般因素与LMM结果的关系
| 项目 |
n |
LMM阳性 |
LMM阴性 |
X2检验 |
| n |
% |
n |
% |
| 男 |
33 |
6 |
18.2 |
27 |
81.8 |
P＞0.05 |
| 女 |
19 |
5 |
26.3 |
14 |
73.7 |
| ＜60岁 |
37 |
8 |
21.6 |
29 |
78.4 |
P＞0.05 |
| ≥60岁 |
15 |
3 |
20.0 |
12 |
80.0 |
| 结肠 |
25 |
6 |
24.0 |
16 |
76.0 |
P＞0.05 |
| 直肠 |
27 |
5 |
18.5 |
22 |
81.5 |
3讨论
细胞角蛋白(cytokeratin，CK)是分子量为40～68KD的蛋白群，作为细胞骨架广泛分布于上皮组织及其来源的肿瘤组织细胞胞浆中，在间叶组织中无表达[6]。针对角蛋白单抗能识别来自上皮系统组织的肿瘤细胞,而对间质细胞无反应这一特点,故其单抗可用来检测胃肠癌[3,4,10～12]、乳腺癌[7]、肺癌[8,9]前列腺癌等患者骨髓或淋巴结中的微小转移灶。细胞角蛋白根据分子量及等电点pH值分为不同亚型,Moll等将其编号为CK1至CK20。本研究检测LMM所用单抗AE1/AE3[8]为抗角蛋白的联合单抗,所抗角蛋白亚型较广(其中AE1为抗CK10,14,15,16,19的单抗,AE3为抗CK1,2,5,6,7,8的单抗),假阴性机会少。在本研究的预实验中,大肠癌原发灶及正常肠组织为100％(10/10)表达。在阴性淋巴结无表达0％(0/10)。除外实验条件的因素,在明确有转移的淋巴结中为100％(10/10)表达。此单抗的敏感性及特异性均好且可作用于石蜡切片,是检测大肠癌患者淋巴结中微小转移灶满意的单抗。
目前国内关于结直肠癌LMM检测及其对生存率的影响尚未见报道。但国内关于上皮系统肿瘤如乳腺癌[7]、非小细胞肺癌[8]的LMM检测已有报道。国外近年来有数篇关于淋巴结或/和骨髓的报道[9～12],均认为若Dukes'A、B期手术患者淋巴结或骨髓中存在微小转移灶则复发率高,无病生存期缩短。JoelK等[11]对50例Dukes'B期大肠癌患者的568个(平均每例11.3个)淋巴结标本用其抗细胞角蛋白单克隆抗体(AE1/AE3)检测隐匿的微小转移灶,结果显示：角蛋白阳性的14例患者(33个淋巴结),其中6例在66个月死亡(43％),而角蛋白阴性的36例患者中仅一例同期死亡(3％,P=0.0009)。此组结果与我组检测结果相似。
术后化疗主要是针对术前已存在的潜在的微小转移灶,以期消除残存的癌细胞,但以往由于没有微小转移灶的客观依据,病例的选择是相对盲目的。本研究表明LMM＋组患者5年生存率及生存期均明显降低,转移率及复发率明显增高,提示这些患者术后应给予辅助化疗,而LMM-组患者术后生存时间较长,可不予预防性化疗。术后放疗的目的是消灭亚临床灶和残存的肿瘤,对于局部复发危险性高或淋巴结有转移的患者能提高疗效,对于淋巴结阴性的患者无效,甚至会由于放射损伤而使患者的生存期缩短。本研究显示微小转移灶的检测对于更准确地分期有很大的意义。在本组病例中常规病理染色为阴性的淋巴结用免疫组化染色时21.15％(11/52)为LMM阳性,说明一些淋巴结中的微小转移灶常规病理学方法不能测出,而用免疫组化方法可以测出,这些N0期患者也许定为N1或N2期更恰当。
总之,若以LMM为预后指标,指导大肠癌早期患者的术后治疗,则可增强针对性,减少高危患者的复发/转移率,延长生存期,提高5年生存率。本研究结果显示LMM＋组的5年生存率及无病生存期明显短于LMM－组。而患者性别、年龄及肿瘤所在部位对微小转移灶无影响。但本研究的样本较小,对肿瘤细胞的分化程度和LMM阳性程度等因素未做统计学处理,还需积累更多的病例以进一步分析。
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收稿日期：1999－07－09；修回日期：2000－01－10
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