B7基因修饰的肿瘤细胞诱导抗大肠癌主动免疫

中国肿瘤临床 2000年第2期第27卷 实验肿瘤

作者：胡锦跃　王飒　朱建高　周国华　孙去病

单位：胡锦跃（湖南医科大学肿瘤研究所 长沙市410078）；王飒（湖南医科大学肿瘤研究所 长沙市410078）；朱建高（湖南医科大学肿瘤研究所 长沙市410078）；周国华（湖南医科大学肿瘤研究所 长沙市410078）；孙去病（湖南医科大学肿瘤研究所 长沙市410078）

关键词：大肠癌免疫学治疗B7基因基因转移

　　摘要　目的：研究B7基因修饰的肿瘤细胞诱导抗大肠癌CTL的活化。方法：采用电击法将B7基因导入小鼠大肠癌细胞CMT93，G418筛选阳性克隆，免疫组化显示B7分子有高效表达，B7^＋CMT93(CMT93－B7)接种于C57BL/6小鼠背部皮下，其致瘤性显著下降（P＜0.01）；CMT93－B7致敏的小鼠对野生型瘤细胞具有免疫保护作用(P＜0.05)；用CMT93和CMT93－B7细胞分别经腹腔免疫小鼠，得到腹腔浸润淋巴细胞及致敏脾细胞，MTT法进行体外杀伤实验。结果：CMT93－B7诱导的CTL(cytotoxicTlymphocyte)对CMT93的杀伤活性显著高于野生型CMT93诱导的CTL对相同靶细胞的杀伤活性(P＜0.05)，并且CMT93－B7诱导的CTL对CMT93－B7的杀伤率显著高于对野生型CMT93的杀伤率（P＜0.05）。结论：B7分子有效地促进抗大肠癌CTL的活化，在CTL的效应阶段B7分子也发挥重要作用。

Anti－ colonic Cancer Active Immunity Induced by B7 Gene Modified Tumor Cells

Hu Jinyue Wang Sa Zhu Jiangao et al (Cancer Research Institute, Hunan Medical University, Changsha)

　　Abstract Objective: To study the activation of CTLs against colorectal cancer cells induced by B7 gene modified tumor cells.Methods: B7 gene was transfected into mouse colorectal cancer CMT93 cells. The positive clones were selected by G418..The immunohistochemistry showed that B7 molecules were highly expressed. The B7＋ CMT93 (CMT93－ B7) cells were inoculated into the back of C57B1/6 mice subcutaneously and then it decreased their tumorigenicity greatly (P＜ 0.01). The CMT93－ B7 cell sensitized mice obtained the protective immune activity against the rechanllenge of wild type CMT93 cells (P＜ 0.05). The abdominal infiltrating lymphocytes and sensitizing spleen cells were obtained from the mice who were immunized with CMT93－ B7 or wild type CMT93 cells intraperitoneally., and the cytotoxicity of these CTLs against tumor cells was detected by MTT assay. Results: It showed that the cytotoxicity of CTL induced by CMT93－ B7 against CMT93 was significantly higher than the cytotoxicity of CTL induced by wild CMT93 against the same target cells (P＜ 0.05).Conclusion: The results suggest that the B7 molecules can effectively promote the activity of CTL against colorectal cancer

　　cells, and B7 molecules play an important role in CTL cytotoxicity function as well.

　　Key Words Colorectal cancer Immunology Therapy B7 gene Gene transfer

　　T细胞活化需要两个信号的作用^[1]，信号1由T细胞受体（TCR）与肽－MHC复合物提供，信号2主要由抗原递呈细胞表面的B7与T细胞表面的CD28相互作用提供。B7提供共剌激信号的途径有三种，其中以第二种顺式共刺激途径即靶细胞同时提供两信号活化T细胞的效果最佳^[2]。肿瘤细胞通常不表达B7分子^[3]，因此不能通过顺式共剌激途径活化T细胞，同时其它途径由于肿瘤细胞的变异可能存在缺陷，从而逃避机体的免疫监视。利用转基因的方法将B7基因导入肿瘤细胞，通过顺式共剌激途径已经诱导较好的抗肿瘤免疫，不仅使正常小鼠排斥B7修饰的瘤细胞，而且对野生型瘤细胞有免疫保护作用^[4,5]。本文通过转导B7基因，探讨B7基因修饰的大肠癌细胞诱导免疫反应的能力及可能机制，为可能的临床应用奠定基础。

　　1　材料与方法

　　1.1　材料

　　C57BL/6(H－2^b近交系小鼠)雌雄不限,6～8周龄，购自中国科学院上海实验动物中心。CMT93细胞株为化学致癌物诱导的C57BL/6小鼠来源的结肠癌细胞株，购自美国ATCC公司。鼠B7（B7.1）质粒pLNSX－mB7由美国西雅图Bristol－MyersSquibb药物研究所的陈列平博士惠赠。大鼠抗小鼠B7单抗购自Pharmingen公司，碱性磷酸酶标记的山羊抗大鼠IgG购自OrganonTeknik公司。G418(Genectin)购自Gibco公司。

　　1.2　质粒制备

　　pLNSX－mB7质粒转化大肠杆菌MC1061，大量扩增后，碱裂解法抽提质粒，PEG沉淀法纯化，电泳鉴定。

　　1.3　电击法转导B7基因

　　收集处对数生长期的CMT93细胞，Hank′s液洗两次，计数，用不含FCS的DMEM调整细胞浓度为5×10⁶/ml。吸取0.8ml，加至1ml电击杯中，加入35μgpLNSX－mB7质粒，冰浴10min，设置电压1.2kV，电容25uFD，实施电击。电击后冰浴10min，吸出细胞至24孔板中，37℃、5％CO₂培养24小时，用含800μg/mlG418的DMEM筛选阳性克隆，2周后用含400μg/mlG418的DMEM培养传代。

　　1.4　免疫组化

　　消化G418筛选后的CMT93，培养于8孔的玻片室（SlideChamber）中，待细胞长至50％～60％，用0.15％的戊二醛固定，检测B7的表达。一抗为大鼠抗小鼠B7单抗(1:200)，二抗为碱性磷酸酶标记的山羊抗大鼠IgG单抗(1:50)，显色底物为NBT/BCIP(10:1)。

　　1.5　致瘤实验

　　收集处于对数生长期的B7＋CMT93(CMT93－B7)，以每只小鼠5×10⁶细胞接种于C57BL/6小鼠背部皮下，以接种同样细胞数的CMT93为对照，实验组共4只小鼠，对照组共3只小鼠(随机分组)，观察肿瘤的生长，并用游标卡尺(精确度0.002cm)测量肿瘤的长径和短径，比较肿瘤的大小(长径×短径)。

　　1.6　免疫保护实验

　　CMT93－B7致敏的小鼠共4只，每只背部皮下接种2.5×10⁶野生型CMT93细胞，以相同细胞数的CMT93接种于4只正常小鼠作为对照，观察肿瘤生长并比较肿瘤大小。

　　1.7　体内致敏体外杀伤实验

　　CMT93及CMT93－B75×10⁶分别接种小鼠腹腔（每组4只），接种后第7天处死小鼠，用5mlHank′s液清洗腹腔，吸出Hank′s液，去红细胞，贴壁法去除腹腔巨噬细胞及残存的肿瘤细胞，得到腹腔浸润淋巴细胞，同时制备小鼠脾脏单细胞悬液，去红细胞，进行细胞毒实验。细胞毒实验采用MTT法^[6]。

　　2　结果

　　2.1　质粒鉴定

　　鼠质粒pLNSX－mB7为SV40启动的真核表达载体^[3]，具有两个HindⅢ酶切位点，图1显示质粒经HindⅢ酶切后为两条带，分别为质粒DNA及B7DNA。

图1　pLNSX－mB7质粒电泳图谱。质粒酶切后为两条带，分别为B7DNA(0.92kb)和质粒DNA

　　lane1:λ/HindⅢmarkerLane2,4:HindⅢ酶切质粒

　　lane3,5:未酶切质粒Lane6:100bpladdermarker

　　2.2　免疫组化

　　经G418筛选后得到的克隆，免疫组化显示明显的阳性染色，主要为胞膜染色，也可见胞浆染色，细胞着色率为62％。野生型CMT93B7表达阴性，免疫组化未见着色。

　　2.3　致瘤实验

　　CMT93及CMT93－B7接种小鼠后，于第7天所有小鼠均出现可触摸的肿瘤，随后对照组小鼠肿瘤呈进行性生长，而实验组小鼠至第二周开始肿瘤逐渐缩小，4只小鼠分别于第12天，第14天(2只)及第32天肿瘤完全消退，其中实验组最大肿瘤为0.990cm×0.302cm(第12天)。每次测量数据经两样本均数的t检验均有显著性差异(表1，图2，3)。

表1　接种CMT93和CMT93－B7瘤细胞后不同时期的肿瘤大小(±s)

　　^＊与接种CMT93瘤细胞组相比，0.005＜P＜0.01；^＊＊与接种CMT93瘤细胞组相比，0.001＜P＜0.002；^＊＊＊与接种CMT93瘤细胞组相比，P＜0.001

图2　CMT93－B7致瘤实验实物照片

图3　CMT93－B7致瘤实验(n=7)

　　－●－：实验组4只小鼠接种CMT93－B7，肿瘤逐渐消退；　　－■－：对照组3只小鼠接种野生型CMT93，肿瘤呈进行性生长(P＜0.01)

　　左排实验组4只小鼠肿瘤完全消退，右排对照组3只小鼠肿瘤进行性生长，图中小鼠背部有溃疡出血的部位为肿瘤生长部位

　　2.4　免疫保护实验

　　CMT93－B7致敏小鼠，再接种2.5×10⁶野生型CMT93，从接种第1天直至第32天，小鼠均未生长肿瘤，而对照组小鼠于第7天全部长出肿瘤，第2周肿瘤有部分缩小，其中1只小鼠于第16天肿瘤完全消退，余3只小鼠从第3周始肿瘤呈进行性生长。每两组数据经两样本均数t检验均有显著性差异(表2，图4)。

表2　CMT93－B7致敏小鼠及未致敏小鼠接种CMT93瘤细胞后不同时期的肿瘤大小（±s）

　　^＊与未致敏组相比，P＜0.001；^＊＊：与未致敏组相比，P＜0.005；^＊＊＊与未致敏组相比，P＜0.05

图4　免疫保护实验（n=8)

　　－■－：实验组4只CMT93－B7致敏小鼠再接种CMT93，无肿瘤生长；－●－：对照组3只正常小鼠接种CMT93，肿瘤呈进行性生长(P＜ 0.05)

　　2.5　体外杀伤实验

　　CMT93及CMT93－B7接种于小鼠腹腔后，均能引起腹腔淋巴细胞浸润，但淋巴细胞数量有所差异，并且腹腔中残存的肿瘤细胞数量也有差别(数量未显示)。杀伤实验中，经CMT93－B7诱导的腹腔浸润淋巴细胞及脾细胞对CMT93的杀伤率均高于野生型CMT93诱导的腹腔淋巴细胞及脾细胞(图5)，而且CMT93－B7诱导的腹腔淋巴细胞对CMT93－B7的杀伤率显著高于对CMT93的杀伤率(图6)。

图5　腹腔浸润淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤率

　　a：CMT93－B7诱导的腹腔浸润淋巴细胞对CMT93－B7的杀伤率（n=4）；B：CMT93－B7诱导的腹腔浸润淋巴细胞对CMT93的杀伤率（n=4）；C：CMT93诱导的腹腔浸润淋巴细胞对CMT93的杀伤率（n=4）；经配对资料t检验：A与B比较有显著性差异（P＜ 0.05)

图6　脾细胞对肿瘤细胞的杀伤率

　　a：CMT93－B7诱导的脾细胞对CMT93－B7的杀伤率（n=4）

　　b：CMT93－B7诱导的脾细胞对CMT93的杀伤率（n=4）

　　c：CMT93诱导的脾细胞对CMT93的杀伤率（n=4)

　　经配对资料t检验：A与B比较有显著性差异（P＜0.05）

　　b与C比较有显著性差异（P＜0.001）

　　3　讨论

　　B7^＋瘤细胞通过顺式共刺激途径活化T细胞，要求肿瘤细胞必需具有免疫原性，对于无免疫原性的肿瘤，转染B7也不能诱导有效的抗肿瘤效应^[3]。CMT93是一株弱免疫原性的瘤细胞，通过转染B7基因，我们发现其致瘤性显著下降，肿瘤形成后，在短时间内可逐渐消退，而对照组肿瘤长时间呈进行性生长（表1，图3）。

　　转染B7的瘤细胞能诱导强有力的免疫反应，其机制是在B7的共刺激作用下，针对肿瘤细胞表面的主要抗原表位的CTL克隆得到了更大的扩增，同时B7共刺激信号“显露”了瘤细胞表面抗原的亚显性表位，使针对亚显性表位的CTL前体活化、增殖，产生免疫效应^[2]，而这些亚显性表位通常情况下不能诱导免疫反应。我们的研究发现，B7＋CMT93接种C57BL/6小鼠后，肿瘤能够消退。而B7＋CMT93致敏的小鼠，再接种野生型CMT93，可不形成肿瘤（表2，图4）。其原因即可能是CMT93－B7瘤细胞表面的亚显性表位在B7的共刺激作用下，已活化了相应的T细胞克隆，再次接种具有相同抗原的野生型CMT93时，即能迅速产生免疫反应。

　　T细胞活化需要B7的共刺激作用，而对于T细胞活化后的效应阶段，多数研究认为并不需要B7的参与，但部分研究得到不一致的结果^[1,7]。免疫保护实验中，CMT93－B7致敏后的小鼠对再接种的野生型CMT93能产生排斥，机体内活化的效应T细胞能有效杀伤B7－的瘤细胞，说明活化T细胞在没有瘤细胞表面的B7共刺激信号参与下，也能发挥杀伤效应。在体外杀伤实验中，用CMT93－B7诱导的CTL对CMT93－B7的杀伤率显著高于对CMT93的杀伤率（图5，6），说明在效应阶段B7同时发挥了作用。推测其机制可能是B7与CD28的相互结合促进了淋巴细胞与靶细胞之间的粘附，也可能是B7与CD28的相互结合促进多肽－MHC复合物与TCR的结合，即B7降低T细胞发挥效应的阈值。综合上述结果我们认为，T细胞效应阶段瘤细胞表面B7共刺激分子并不是必需的，但它能加强T细胞的杀伤效应。

(韩豫生校对)

　　^＊本文课题受国家自然科学基金资助（编号3950076）

　　参考文献

　　1，Chen L, Linsley PS, Hellstrom KE. Costimulation of T cells for tumor immunity. Immunol Today,1993;14:483～ 96

　　2，Chen L. T cell costimulation and tumor immunity.中 国 肿 瘤 生 物 治 疗 杂 志 , 1996,3(2):86～ 95

　　3，Chen L, McGowan P, Ashe S, et al. Tumor immunogenicity determines the effect of B7 costimulation on T cell－ mediated　tumor immunity. J Exp Med,1994;179:523～ 32

　　4，Baskar S, Ostrand－ Rosenberg S, Nabavi N, et al. Constitutive expression of B7 restores immunogenicity of tumor cells　expressing truncated major histocompatibility complex class II molecules. Proc Natl Acad Sci USA, 1993;90: 5687～ 90

　　5，Li Y, McGowan P, Hellstrom I et al. Costimulation of tumor－ reactive CD4^＋ and CD8^＋ T lymphocytes by B7, a natural ligand for CD28, can be used to treat established mouse melanoma. J Immunol, 1994;153:421～ 8

　　6，Heo DS, Park JG, Hata K, et al. Evaluation of tetrazolium－ based semiautomatic colorimetric assay for measurement of human antitumor cytotoxicity. Cancer Res, 1990;50:3681～ 90

　　7，Ramarathinam L, Castle M, Wu Y, et al. T cell costimulation by B7/BB1 induces CD8 T cell－ dependent tumor rejection:An important role of B7/BB1 in the induction, recruitment, and effector function of antitumor T cells.J Exp Med,1994;179:1205～ 14

(1999－02－25收稿)