间接免疫荧光法及蛋白质印迹法对肺癌患者体内自身抗体的分析

　　第二军医大学学报2000年第21卷第4期

夏晴　仲人前　范列英　高春芳　薛昌　孔宪涛

　　摘　要　目的：了解肺癌患者血清自身抗体阳性率、细胞内定位及荧光图形特点，探索自身抗体作为肿瘤标志物的可能性。方法：应用间接免疫荧光法（indirect immunofluorescence,IIF）检测77份肺癌以及140份不同年龄段正常人血清中自身抗体。提取人喉癌上皮细胞（Hep-2）蛋白抗原，采用蛋白质印迹法对81份肺癌患者及52份正常人血清进行分析。结果：肺癌组和对照组的自身抗体阳性率有显著差别，两组人群的自身抗体阳性率皆随年龄增长而增高（P＜0.05），在不同年龄段，肺癌组皆显著高于对照组（P＜0.01）。肺癌组和对照组在自身抗体荧光图形、靶抗原细胞内定位上均有明显不同。74份肺癌患者血清中检测到阳性条带（74/81,91.4%），显著高于对照组（31/52，61.5%），其中大多数与自身免疫性疾病中常见的自身抗体不同，并发现82.7%(67/81)的肺癌患者具有针对相对分子质量初步鉴定为6.5万的靶抗原的阳性条带，该条带仅在22.2%（12/52）的正常人中查及。结论：肺癌患者血清的自身抗体谱与正常人生理性自身抗体谱及自身免疫性疾病中的自身抗体谱不同，进一步研究其靶抗原本质及其生物学意义，有助于深入认识肺癌患者自身免疫现象，并有可能应用于肺癌的诊断。

　　关键词：肺肿瘤；自身抗体；印迹法，蛋白质

　　肿瘤患者体内查及自身抗体，始报道于1972年Whitehouse发现肿瘤患者体内存在抗平滑肌抗体。20多年来国外陆续报道了肿瘤患者体内存在抗细胞质或（和）细胞核成分的自身抗体^［1］。肺癌患者有时以副肿瘤性神经肌肉障碍为先期症状，目前已证实自身免疫在副肿瘤综合征的病理机制中起着重要作用，明确了抗突触前钙离子通道抗体在副肿瘤性Eaton-Lambert肌无力综合征^［2］、抗蒲肯野细胞抗体在副肿瘤性小脑退化中的致病作用^［3］。提示肺癌与自身免疫间有着某种联系，而自身抗体的出现就可能起到预示肿瘤发生的作用。国外学者用ELISA法在肺癌中查及抗P53抗体^［4］，但目前对于肺癌患者自身抗体谱的报道还不多见。对抗体谱及其靶抗原本质的研究有助于深入认识肺癌患者的自身免疫现象，为自身抗体应用于肿瘤诊断、治疗的潜在可能性提供更多信息。本研究用间接免疫荧光(IIF)、蛋白质印迹两种方法对肺癌患者及正常人血清中的自身抗体进行了分析，现将结果报道如下。

　　1　材料和方法

　　1.1　研究对象　经临床确诊的原发性肺癌患者81例。男47，女34，年龄31～86岁，平均年龄60.67岁。正常对照组源于正常体检者，共140名，其中男107，女33，年龄23～84岁，平均50.89岁。

　　1.2　IIF检测　IIF检测自身抗体试剂盒由德国Euroimmun Stocker博士惠赠。抗原基质为已固定在载玻片上的Hep-2细胞，荧光二抗为FITC标记的羊抗人IgG。实验步骤按试剂盒所附说明书进行，滴度高于1∶100者报告为阳性。

　　1.3　蛋白质印迹　Hep-2细胞培养至致密单层，预冷的PBS漂洗细胞两次，加入裂解液（50 mmol/L Tris-HCl pH 8.0,150 mmol/L NaCl,0.02% NaN₃,0.1% SDS,1% nP-40,0.5%脱氧胆酸钠，蛋白酶抑制剂），冰育20 min，收集于微量离心管中，4℃，12 000×g离心2 min，上清即为蛋白提取液。提取液采用Laemmli sDS-PAGE电泳系统，配置12%及7%两种不同浓度的丙烯酰胺凝胶进行电泳，后转印到硝酸纤维滤膜上（Bio-Rad电泳及转印仪）。凝胶及滤膜由预染蛋白（Bio-Rad）校准相对分子质量。滤膜剪为细条，用含5%脱脂奶粉、0.02% tween　20，0.02% NaN₃的PBS（pH 7.4）4℃过夜封闭，血清1∶50稀释后，与滤膜室温下温育60 min，洗涤后，滤膜与碱性磷酸酶标记的兔抗人IgG稀释液温育60 min，经底物显色后判定结果。

　　1.4　统计学处理　阳性率间比较均采用χ²检验。

　　2　结　果

　　2.1　IIF检测　血清由1∶100稀释后，77份经IIF检查的肺癌患者中，43份（57.14%）自身抗体阳性,显著高于正常对照组（17.14%）的检出率（P＜0.01）。将肺癌组和对照组按年龄分为3组，结果分析显示：随年龄增高，两组阳性率都有增高趋势，而各年龄段肺癌组皆显著高于对照组，详见表1。

表 1　肺癌组及对照组不同年龄段自身抗体阳性率比较

　　tab 1　Comparison of positive rates of autoantibodies

　　in lung cancer and control groups different age

　　^*　P＜0.05,^**P＜0.01 vs control group;　 △P＜0.05,^△△P＜0.01 vs the group of age20-; ▲P＜0.05,^▲▲P＜0.01 vs the group of age 41-　　荧光显微镜下观察自身抗体细胞内定位的结果显示：肺癌组自身抗体阳性者中以抗核质成分为主，占79.07%（34/43）；其次为胞质，占30.23%（13/43）；抗核仁阳性有9份，占20.93%。与此相比较，对照组抗胞质、核仁阳性皆少见，各有8.33%（2/24），24份自身抗体阳性血清皆呈现抗核质抗体阳性。分析荧光图形，肺癌组阳性血清以核质细颗粒为主（22/43），核质斑点状阳性有9份，核质均质型2份，染色质阳性13份，核点1份。胞质细颗粒阳性8份，粗颗粒4份，另外还观察到抗增殖细胞核抗原（PCNA）阳性1份，抗中间体1份。对照组抗体荧光类型不如肺癌组多样，24份正常人阳性血清中，核质细颗粒阳性20份，核质分散斑点型2份，核质均质型1份，胞质细颗粒2份，抗中心体阳性2份。

　　2.2　蛋白质印迹　81份肺癌患者及52份正常人血清以1∶50稀释后，与电转印到硝酸纤维滤膜上的Hep-2抗原成分温育反应后，经碱性磷酸酶标记二抗显色反应系统显示：74份肺癌患者可见抗原抗体反应的阳性条带，阳性率为91.4%，显著高于对照组（P＜0.05），后者32例出现阳性条带（61.5%）。肺癌组抗原谱较宽，相对分子质量分布广泛（20000～170 000），阳性血清中皆不止一种自身抗体，多数有3，4种阳性条带，少数患者阳性条带多至8条。对照组抗原谱相对较窄，多数阳性血清中呈现1～2条阳性条带，个别多至5条阳性条带。还发现67份（82.7%）肺癌患者血清具有一阳性共带，其相对分子质量经标准蛋白对照测算，约为65000，正常对照组该条带阳性率为22.2%（12/52），两组间差别显著（P＜0.01）。(图1,见封三下)。

图1Hep-2全细胞解液免疫印迹法检测肺癌患者及正常人血清部分结果

　　fig1Part western blotting results of lung cancer patients (B) and controls (A) with Hep-2

　　a1~10: 10 normal control; B1, B3~10: Lung cancer patients, the 65 000 band was figured out with arrow

　　3　讨　论

　　本研究结果证实，肺癌中存在以自身抗体为表现的自身免疫现象。众所周知，一定比例正常人存在着生理性自身抗体，且随年龄增长阳性率增加，这与肿瘤发病率随年龄增长而增加相似，因此，对肿瘤患者的自身抗体是否具有肿瘤相关性，或只是反映肿瘤的高龄发病性也存在着争论^［5］。本研究将正常对照组与肺癌组分为20～40，41～60，61岁以上3个年龄段。IIF检测结果显示，两组在3个年龄段皆查及针对细胞不同成分的自身抗体随年龄增长阳性率皆增高，但各年龄段肺癌组阳性率皆显著高于相应对照组。比较两组自身抗体的荧光图形和细胞内定位，值得注意的是肺癌组荧光图形比对照组类型丰富，特别是抗胞质（16.88%，13/77）、核仁（11.68%,9/77）阳性率高于对照组,后者抗胞质、核仁阳性率均为1.43%（2/140）。已知核仁、胞质内含有核糖体蛋白等，是与细胞生长、增殖过程密切相关的蛋白质，这提示肺癌患者体内自身抗体相应的靶抗原可能是某些与细胞的生物合成或增殖有关的蛋白质。国外学者曾报道肝癌中抗核仁抗体阳性率（6.56%）较正常人增高，并鉴定出3种核仁内靶抗原：NOR-90/人类上游结合因子（Hubf）、原纤维蛋白、B23蛋白，它们均参与核糖体RNA的处理过程，在细胞生长和增殖过程中这些蛋白质含量或活性均有明显升高^［6］。对应蛋白质印迹结果，肺癌组阳性条带相对分子质量分布广于对照组，即肺癌组抗体谱较正常人宽，表明肺癌患者自身免疫反应不同于正常人生理性自身免疫反应。这些扩大的抗体谱可能是由于细胞转化或肿瘤进展过程中异常出现的某些新的胞内抗原，诱发机体免疫系统针对这些新的抗原产生免疫反应；也可能是由于癌基因在转化过程中伴随着某些正常蛋白的显著过量表达，刺激那些在胸腺发育过程中由于低量表达而逃开清除从而进化到外周的正常状态下无反应性T淋巴细胞，导致非生理性的自身抗体的产生。这就为用自身抗体鉴别诊断正常人与肿瘤患者，甚至治疗肿瘤提供了理论上的可能性^［7，8］。

　　以神经-肌肉症状为表现的副肿瘤综合征易伴发于肺癌、卵巢癌等肿瘤，患者有时以肢体共济失调、言语呐吃、脊髓损害、肌力减退、肌肉萎缩等神经肌肉症状为先期症状。Igarashi^［9］曾报道1例以副肿瘤性小脑退化入院的患者，在脑脊液和血清中检测到58000的抗蒲肯野细胞抗体，成功地先于CT，MRI作出了卵巢癌诊断。这表明对以副肿瘤综合征为表现的患者检测自身抗体是有价值的，同时提示自身抗体有可能作为肿瘤诊断的指标。

　　本研究蛋白质印迹显示，肺癌患者的自身抗体谱分布比较广泛，患者体内大多不止一种自身抗体。现已明确的肺癌中可能出现的自身抗体有抗P53抗体、抗突触前钙离子通道抗体、抗蒲肯野细胞抗体，后两种自身抗体分别介导副癌性Eaton-Lambert肌无力综合征、副癌性小脑退化中的致病。而肺癌患者的自身抗体靶抗原本质以及它们的生物学和临床意义，还有待不断努力加以进一步阐明。本研究发现，肺癌患者65000处阳性共带，对其靶抗原本质包括蛋白质等电点分析、氨基酸序列分析等深入研究正在进行。同时进一步开展其他癌肿，如胃癌、直肠癌、肝癌等的相应研究，比较不同癌肿自身抗体谱，明确其靶抗原本质及生物学和临床意义，对于深入认识肿瘤中的自身免疫现象具有重要意义。

　　参考文献

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