麦芽凝聚素层析柱纯化的肺癌相关抗原

免疫学杂志 2000年第2期第16卷 基础免疫学

作者：王秦秦　姜 平　李继梅　唐睿珠　陈新明

单位：昆明医学院第一附属医院肿瘤研究所，云南 昆明 650032

关键词：麦芽凝聚素层析柱；肺癌相关抗原；亚细胞结构；细胞有丝分裂；中心粒

　　摘　要：目的纯化并分析肺癌相关抗原的有关特性。方法采用商品化麦芽凝聚素Wheatgerm lectin—Sepharose—6MB层析柱和自制抗人肺痛单克隆抗体N—35—Sepharose—4B层析柱纯化肿瘤相关抗原，比较纯化结果；用免疫印技术测定肺癌相关抗原在肺癌、肝癌、宫颈癌、乳腺痛细胞及正常人心脏及肺组织的存在及分布情况；用差速离心技术分析肺癌相关抗原在亚细胞结构的布状况；用免疫荧光技术探测肺癌相关抗原在肿瘤细跑有丝分裂过程中的染色体结构定位。结果 经麦芽凝聚素纯化的肺癌相关抗原N35以不同分子量形式存在于肺癌、肝癌、宫颈癌及乳腺癌细胞的蛋白组分中，在正常人心脏及肺组织中无表达；在亚细胞结构中主要分布于胞核，线粒体次之,胞膜上分布最少，主要不以膜蛋白或跨膜蛋白的形式存在，并定位于肿瘤细胞有丝分裂中期(methaphase)的中心粒(centriole)结构上。结论 肺癌相关抗原N35是一种重要的肿瘤相关抗原，其功能很可能与肿瘤细胞无限制增殖活动有关。麦芽凝集素亲和层析法是纯化肺癌相关蛋白N35简便有效的途径。

　　分类号：R730　文献标识码：A

　　文章编号：1000-8861（2000）02-0087-05

A lung cancer associated antigen puritied by the Wheatgerm Lectin-Sepharose-6MB

wANG Qin-qin,JIANG Ping,LI Ji-mei,TANG Rui zhu

　　Abstract：Objective To purify and characterize lung cancer associated antigen. Methods Purification by Wheat Germ Lectin-Sepharose-6MB , immunoblotting, differentail centrifigation and subcellular assay, mitotic cell immunoflourescence have been used to identify the lung cancer associated antigen. Results The lung cancer associated antigen could be purifized in large-scaie by Wheat Germ Lectin-Sepharose-6MB more convinient than N-35-Sepharose-4B.The lung cancer associated anti-gen was distributed in GLC-82,Hela,HepG-2,and PMC with different Mr,but no expression in the protein ingredient of nor-mal human heart and lung fresh tissues. It concertrated at the nuclei significantly,much more than at the mitochondrail and membrane. It was orginated at the centriole of the chromosomal domakn. Conclusion The lung cancer associated antigen N35 might be an important tumor associated antigen and related with the proliferation of cancer cells as a role of tumor cell growth regulator.

　　Keywords：Wheatgerm Lectin-Sepharose-6MB;lung cancer associated antigen;subcellular assay;mitosis;centriole 采用WheatGermLectin-Sepharose-6MB层析柱和自制抗人肺癌单克隆抗体N-35-Sepharose-4B层析柱分别纯化肺癌相关抗原N35，结果提示WheatGermLectin-Sepharose-6MB层析柱是一种纯化肺癌相关抗原N35的简便有效方法。经免疫印迹、N-聚糖酶切割、差速离心、免疫荧光等方法检测，证实肺癌相关抗原N35为-糖蛋白分子，分子量在75～130kD之间，经N-聚糖酶切割后的相关抗原N35分子量由MW75X-130kD分解为65kD，84kD，86kD三个不同的小片段。其在亚细胞结构的分布密度依次为细胞核→线粒体→细胞膜。在进行有丝分裂的肿瘤细胞中，该抗原分子定位于分裂S期的中心粒上，提示其功能很可能与肿瘤细胞增殖活动密切相关[1]。

　　 1材料与方法 1.1组织、细胞和单克隆抗体云南个旧肺腺癌细胞系GLC-82和抗人肺癌单克隆抗体F-19，SIA-2和N—35由本所制备[2,3] 1.2N—35—Protein—A—Sepkarose—4B免疫亲和层析法纯化相关蛋白N35参考文献常规进行。AMICOM气压超滤系统由Phamacia提供；麦芽凝聚素6BM(WheatgermLectin—Sepharose—6MB)、Sepharose—4B及蛋白A—Sepharose4B,由SIGMA公司提供。

　　 1．2．1浓缩单克隆抗体N—35培养上清：1％BSA封闭N2气压超滤膜。PBS冼滤膜20min,将滤膜放入AMICOM气压管底部(外圈加胶垫)。加60ml待纯化的N—35培养上清至AMICOM管，加氨气4.5大气压，控制流液滴速不高于10滴/min，4℃,2h。AMICOM气压管底部剩余待纯化的N—35培养上清0．5ml时．关闭N2气体，吸取浓缩液3．5ml，并用PBS冲洗AMICOM管，收集洗液，共获10：1浓缩待纯化的N—35培养上清6Ml，20℃存放。

　　 1．2．2蛋白A—Sepharose4B柱纯化单克隆抗体N—35:Tris缓冲液(pH8，6)浸泡、膨胀蛋白A—Sepharose4B4℃过夜。PBS洗涤蛋白A—Sepharose4B柱。加入浓缩N35上清，4℃旋转过夜。PBS洗柱,至PA法测试洗出液无蛋白。盐酸甘氨酸缓冲液(pH2．3)洗脱。0．05mol／LTris缓冲液(pH8．1)透析冼脱液，至pH7．2。SDS电泳测试纯化单克隆抗体N—35，确定重链、轻链的MW150kD、50kD片断。—20℃保存纯化单克隆抗体N—35。

　　 1．2．3制作N—35—Protein—A—Sepharose4B层析柱：加6ml纯化单克隆抗体N—35透析袋，封闭两端。透析袋浸入Coupling交联液50ml，磁力搅拌，4℃过夜。更换新交联液,4℃,6h。收集交联状态单克隆抗体N—35．4℃存放。1mmol／LHCL洗涤Sepharose4B，使膨胀，Coupling交联液悬液、洗涤Sepharose4D。透析后呈交联状态的纯化单克隆抗体N—35与交联状态Sepharose4B混合，4℃旋转过夜。0．2mol／L甘氨酸缓冲液，室温封闭2h。醋酸缓冲液洗涤封闭后胶粒，4℃存放。

　　 1．2．4N—35—Sepharose4B层析柱纯化相关蛋白N35：pH2．3盐酸甘氨酸冲液洗涤N—35—Sepharose—4B层析柱、0．1%NP40洗涤N35—Sepharose4B层析柱、GLC—82细胞裂解液上清加入N—35-Sepharose—4B层析柱，柱内保持5min，重复3次。PA法测定亲合层析前后GLC—82细胞裂解液蛋白量，确定结合效果。O．1％NP4050ml洗柱。0．1mol／L盐酸甘氨酸缓冲液(pH2．3)洗脱N35相关蛋白，分管收集洗脱物，免疫印迹法测定各管相关蛋白N35量。

　　 1．3麦芽凝疑素层析柱(WheatGermLectin—arose—6MB)亲和层析法纯化N35相关蛋白参考文献[4]改进。醋酸甘氨酸缓冲液洗涤麦芽凝聚素Sepharose—6MB层析柱、加GLC—82细胞裂解液上清过柱,每次保留5min，重复4次。醋酸甘氨酸缓冲液洗涤层析柱、0．2mol／LN—乙酰葡糖胺冼脱N—35相关蛋白、分管收集。免疫印迹法测定各管相关蛋白N35量。

　　 1．4相关蛋白N35在不同组织及细胞中的分布收集传代培养的肿瘤细胞GLC—82。Hela、HepG—2及PMC(细胞量不低于1×107)，用PBS洗涤。将手术切除的正常人心、肺组织制成细胞悬液备用。于各标本中加入PSB，置100℃加热2min。各取100μl加样丁SDS—PAGE凝胶中，常规电泳40min。电泳后，经电转仪转移至NC膜上(20V电压、50mA电流/膜)，用1%BSA封闭NC膜4℃过液，加1：100纯化的mAbN—35与NC膜共温育(室温1h)。用PBS—T洗涤NC膜；加1：500酶标记的兔抗鼠二抗(室温1h)。再以PBS—T洗涤NC膜(彻底洗净RaM—HRP)。加化学发光剂ECL(Enharced：Luminol=1：1)覆盖NC膜(室温2min)。置X光胶片上曝光5～15min，分析结果。

　　 1．5差迷离心测定相关抗原N35在亚细胞结构的表达参考文献[5]进行。高速和超速离心采用Baekman公司GPR1900和TL—100型，Sowal公司SRSCHB—4Rotor型。PMSF及Hepes缓冲试剂由BioRad提供。收集培养GLC—82细胞1×107，PBS洗涤。用PMSF缓冲液破碎细胞。1900r/min(600g)10min，4℃，轻取上清，获沉降物A，加PMSF缓冲液保存。加适量PMSF洗涤液于A上清,10000r/min(10000g)20min,4℃。收集沉淀物B，加PMSF缓冲液保存。加适量PMSF缓冲液于B上清，50000r/min(26000g)60min4℃，收集沉降物C。收集C上清、A、B、C沉降物，初始细胞裂解液分别加样，用抗人肺癌单克隆抗体N—35作为免疫探针，经免疫印迹法测定相关抗原N35在各亚细胞结构中的分布。

　　 1．6免疫荧光法检测相关抗原N35在有丝分裂细胞中的定位参考文献常规进行。SaMFICT荧光试剂及NP—40、33242DNA—DYE由HOECHST和DAKO公司提供。无菌载玻片上培养待检细胞24h。收获培养细胞，1％NP—40处理10min。设单克隆抗体N—35组、无关单克隆抗体组(MaH胰岛素单抗)。加单克隆抗体，37℃温育30Min，SaM—FICT荧光二抗，室温20min，PBS洗涤。加33342DNADye复染DNA，中性树脂封片后镜下观察。

　　 1．7N—聚糖酶(N—Glycanase)酶解相关蛋白N35参考文献[6]改进。N—聚糖酶(N—Glycanase)由BioRAD提供。收集培养的待检测细胞,洗涤。NP—40缓冲液裂解细胞，4D℃，30Min。15000r/mid，10min，4℃；取Z7μl裂解液加25μlN—Glycanase，37℃,2h或4℃过夜。SDS电泳及免疫印迹法观察结果。

　　 2结果 2．1N—35—Sepharose4B层析柱纯化相关蛋白N35GLC—82细胞裂解液上清经N35—Sepharose4B层析柱纯化后从第5泳道开始表达N35相关蛋白至第12泳道，第13～15泳道为对照系统，见图1。

　　 图1N-35-Sepharose4B层析柱纯化相关蛋白N35 Fig1ThepurificationofproteinN35byimmunoaffinitychromatographywithN-35-Sepharose-4B:ThepurificationofproteinN35formthecelllysateofGLC-82bythemABN-35Sepharose-4Bcolumn Thelinesof1～12werethesamplesoftheelutionformthemABN-35-Sepharose-4Bcolumn.TheproteinN35wasdetectedformline5toline12.Thelines13～15werethecontrolsystem.

　　 2．2麦芽凝聚素层析柱(WheatGermLectin—Sepharose—6MB)亲和层析法纯化N35相关蛋白GLC—82细胞裂解液上清经麦芽凝聚素Sepharose—6MB亲合层析柱纯化后从第5泳道开始表达N35相关蛋白至第10泳道，第12～14泳道为对照系统，见图2。

　　 图2麦芽凝聚素层析柱亲和层析法纯化N35相关蛋白 Fig2ThepuriffcationofproteinN35formthecelllysateofGLC-82bytheWheaterm-Lectin-Sepharose-6MBcolumn Thelinesof1～10werethesamplesoftheelutionfromthemABN-35-Sepharose-4Bcolumn.TheproteinN35detectedfromline5toline10.TheLines12～14werethecontrolsystem.

　　 2．3相关蛋白N35在不同组织及细胞中的分布图3中1、2、3、4、5、6泳道分别为Hela、GLC—82、HepeG—2、PMC、正常人心脏组织和正常肺组织。N—35mAB所识别相关蛋白N35以不同分子量的形式分布于GLC—82(Mr≈75×103～130×103),Hela(Mr≈75×103～130×103)，HepG-2(Mr≈90×103～110×103)和PMC(Mr≈80×103～95×103)细胞的蛋白组份中；在正常人心脏及肺组织蛋白组份中未见表达。

　　 图3相关蛋白N35在不同组织及细胞中的分布 ThedistributionofproteinN35invarioustissuesandcellsbyWesternblotshowedthatthelineso

　　f1,2,3,4,5and6wereseparately:Hela,GLC-82,HepeG-2,PMC,normalhumanheartandlungtissues TheproteinN35detectedbymABN35distributedinGLC-82(Mr=75×103～130×103),Hela(Mr≈75×103～130×103),HepG-2(Mr≈75×103～130×103)andPMC(Mr=80×103～95×103)withdifferentMr,butnoexpressionintheproteiningredientofnormalhumanheartandlungfreshti

　　ssues.

　　 2．4差速离心测定N—35相关抗原在亚细胞结构的表达经差迷离心法分别获细胞碎片，核成分，线粒体成份和细胞膜成分。在100μg/well平均蛋白量或平均体积量10μl/well的条件下，经用免疫印迹法显示，N—35相关蛋白主要分布于核成分中，线粒体次之，膜成分含量最少，末次差速离心上清成分已无N—35相关蛋白可测出,表明经3次差速离心后细胞裂解液中的有关成分已完全收集，见图4。

　　 图4N35相关抗原在亚细胞结构的表达 Thelinesof1,2,3,4and5wereseparately:cellresidue,supernatantformlastaltracentrifuga

　　tion,nuclei,mitochondriaandmembraneofthecelllineGLC-82thatharvestedfromthedifferentialcentrifugation Westernblotsubcellularassay(volume:100μl/wellorproteinamount:10μg/well)showedtheassociatedproteinN35distributedonthenucleisignificantly,muchmorethanthatonth

　　eminochondrailandmembrane.

　　 2．5免疫荧光法检测相关抗原N35在有丝分裂细胞中的功能定位图5(A、B)为单克隆抗体N—35对同一视野有丝分裂中期(methaphasc)细胞的免疫荧光染色经不同光源获得的图像。图5A为33342DNADye染色的DNA图像，可见丝分裂细胞中蓝染的DNA结构。图5B可见对应于图5A蓝染的DNA结构两侧的中心粒处出现清析的免疫荧光染色，并对称分布于赤道板(eqautorialplate)两级，显示了相关蛋白N35在细胞有丝分裂中期的重要的功能定位。

　　 图5A33312DNADye染色的DNA图像图5B免疫荧光染色图像 Fig5AShowedtheDNA(equatorialplate)staninginblueFig5BShowedthespecialflourescencestiningoftheproteinN35atthecentriolessy

　　mmetricallyonthebothsidesoftheequatorialplate Fig5Aand5Bwereexposedfromthesamefieldexactlywithdifferentfluorescencesource.

　　 2．6N—聚糖酶N—Glycanase酶解N35相关蛋白见图6。GLC—85胞裂解物经用N—Glycanasc消化(37℃．1h),再以单克隆抗体N—35免疫探针行免疫印迹实验。第1泳道可见消化后的N—35相关蛋白巾分解为MW65kD，84kD，86kD三个不同的小片段。第2泳道可见未经消化的N—35相关蛋白，MW75～30kD。

　　 图6N—Glycanase酶解N35相关蛋白 Fig6TheassayofcnzymedigestionofproteinN35byN-GlycanaseandWesternblot Line1showed3bandsof65×103.84×103and85×103fromthedigerstedlysateofGLC82cellsbyN-

　　glycanase.Line2showed1bandof75×103～130×103thelysatebeforedigestion.

　　 3讨论 在肿瘤治疗的研究中，3种重要的生物大分子靶,即酶、受体、核酸，一直受到很大的重视。近年来由于蛋白质化学技术的飞速发展，一些重要的酶和受体己经分离纯化，有的已获得晶体结构，随之而来的以蛋白质及其编码基因为靶分子的研究也取得了令人瞩目的结果[7]。免疫组化技术证实抗人肺癌单克隆抗体N—35的特异性已如前述[3]，本文以抗人肺癌单克隆抗体N—35为免疫探针，经免疫印迹法再次确定了其相关抗原N35以不同分于量形式存在于肺癌细胞系GLC—82、宫颈癌细胞系Hela、肝癌细胞系HepG—2、乳腺癌细胞系PMC的蛋白组份中，在正常人心脏及肺组织中无表达。WheatgermLectin是—种与细胞糖蛋白有良好亲合性的凝集素[4]，我们采用白制的N—35—Sepharose—4B层析柱和商品化麦芽凝集素层析柱WheatGermLeclin—Sepharose—6MB(Parmacia提供)纯化相关蛋白N35获得同样满意的效果,为大量纯化相关蛋白N35提供了一种快速简便的途径。确定抗人肿瘤单克隆抗体所识别的抗原分子及其编码基因的有关特性，对于研究这些分子在恶性肿瘤细胞生物学行为中的作用具有十分重要的意义[8]。真核细胞的糖蛋白分子通常以膜蛋白和跨膜蛋白的形式存在，并多具有受体和通道的功能[9]。在本研究中经N—聚糖酶切割后，相关抗原N35的分子量由MW75～130kD分解为65kD，84kD，二个不同的小片段，证实N—35相关抗原是一种糖蛋白分子，但主要集中在肿瘤细胞的胞核成分，在亚细胞结构的分布密度依此为胞核一线粒体一胞膜，不支持相关蛋白N35是以膜蛋白或跨膜蛋白的形式存在。在进行有丝分裂的GLC—62细胞中，该蛋白分了定位于分裂中、后期的中心粒上，不仅进一步提示相关蛋白N35主要是一种核蛋白，而且其功能极可能与肿瘤细胞增殖活动密切相关[10]，具有重要的研究前景和开发价值。

　　基金项目：国家自然科学基金资助项目(39960078)

　　作者简介：王秦秦(1949-),男，山西五寨县人，副主任医师,大学,主要从事肿瘤免疫学研究。参考文献：

　　［1］LINGLE WL,LUTZ WH,INGLE JN,et ah Centrosome hypertrophy in buman breast tumors:implications for genomic stability and cell polaryity[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1998,95(6):2950～2956.

　　［2］梁明达，胡美英，贾 伟，等，云南个旧肺腺癌细胞系GLC-82的建立及特性分析[J]，中华肿瘤杂志，1985，7(2):81～83.

　　［3］王秦秦，郝 萍，孟 桦，等抗入肺癌单克隆抗体研制及免疫组化分析543例[J].中华肿瘤杂志, 1992, 14(6) :473～75.

　　［4］NADIMPALLI SK,KOMPELLA P. Affinity purifica-tion of N-acetylglucosamine specific lectins. Purification and partial charactersation of triticale lection[J].Biochem Mol Biol int, 1996,38(5): 1059～1066.

　　［5］TOMAS JE,SMITH M,RUBINFELD B,et al. Subcellular localization and analysis of apparent 180-kDa and 220-kDa proteins of thebreast cancer susceptibility gene,BRCA1[J]. Biol chem, 1996,271 (45): 28630～28635.

　　［6］AHMAD S ,AMOUDY HA ,THOLE JE. Identification of a hovel protein antigen encoded by a mycobacterium tuberculosis specific RD1 region gene[J]. Scand J Immuno1.1999.49(5) :515～522.

　　［7］杨铭，以DNA为靶的小分子药物研究中的分子识别[J].北京医科大学学报, 1998,30( 2), 1～3.

　　［8］KATO S,ISHIHARA K,SHINOZAWA T,et al,Monoclonal antibody to human midkine reveals increased midkine expression in human brain tumors[J]. J Neu ropathol Exp Neurol,1999.58(5) :430～441.

　　［9］陈诗书，汤雪明，王一飞，等．医学细胞与分子生物学[M].上海医科大学出版社，1996. 316.

　　［10］BOBINNEC Y,KHODJAKOY LM,MIR CL, et al, Centriole disassembly in vivo and its effect on centro-some structure and function in vertebrate cells[J].Nucleosides, 1999,18(1) :12515～12516.

收稿日期：1999-07-27

修稿日期：1999-11-16