肺癌p53蛋白表达和基因突变与临床病理的相关研究

中华病理学杂志 1998年第4期第27卷 *论著*

作者：张骏　郑杰　方伟岗　由江峰　钟镐镐　衡万杰　吴秉铨

关键词：肺肿瘤；蛋白质p53；基因p53；突变；预后

　　【摘要】　目的　检测肺癌中p53蛋白表达和基因突变状况及其与临床病理和预后的相关性。方法　应用免疫组织化学(LSAB法)和聚合酶链反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)二种方法。结果检测肺鳞癌46例、肺腺癌49例，共95例。免疫组化p53蛋白总阳性率为50.5%(48/95例)，肺鳞癌阳性率为56.5%(26/46例)、肺腺癌为44.7%(22/49例)。PCR-SSCP检测p53基因突变率为41.1%(39/95例)，肺鳞癌突变率为47.8%(22/46例)、肺腺癌为34.7%(17/49例)。突变位于第5外显子者有15例(38.5%)；6外显子3例(7.7%)；7外显子13例(33.3%)；8外显子8例(20.5%)。两种方法检测的符合率为77.9%(74/95例)。N0(无淋巴结转移)、N1(第一站，转移到支气管周围或同侧肺门淋巴结)、N2(第二站，转移到同侧纵隔淋巴结及隆突淋巴结)期肺癌p53突变率分别为22.6%(7/31例)、44.2%(19/43例)、61.9%(13/21例)，差异有显著性(P＜0.025)；95例肺癌中，生存率低于3年组和高于3年组患者的p53突变率分别为51.9%(27/52例)、27.9%(12/43例)，差异有显著性(P＜0.025)。结论　肺鳞癌和肺腺癌中p53突变多发生在第5和第7外显子；伴有p53基因突变的肺鳞癌和肺腺癌患者更易发生淋巴结转移，其3年生存率明显降低。

　　p53 alterations in human lung cancer and their correlation with clinicopathological features and prognosis　Zhang Jun, Zheng Jie, Fang weigang，et al. Department of Pathology, Beijing Medical University, Beijing100083

　　【Abstract 】　Objective　To investigate p53 protein accumulations and p53 mutations in squamous cell carcinoma and adenocarcinoma of the lung and their correlation with clinicopathological features and prognosis.Methods　Immunohistochemistry(LSAB) and non-isotopic PCR-SSCP were used to detect p53 abnormalities in lung cancer.Results　The general positive rates for immunohistochemistry using anti-p53 monoclonal antibody Do-7 (DAKO) as first antibody was 50.5% in 95 cases of lung cancere, 56.5% (26/46) in squamous cell carcinoma and 44.9% (22/49) in adenocarcinoma. PCR-SSCP results showed that 39 cases (41.1%) showed abnormal bands. The mutation rate in squamous cell carcinoma was 47.8% (22/46) and 34.7% (17/49) in adenocarcinoma. In 15 (38.5%) cases, the mutations were located on exon 5, 3 (7.7%) were on exon 6, 13 (33.3%) on exon 7 and 8 (20.5%) on exon 8, respectively. The concordance rate of immunohistochemistry and PCR-SSCP was 77.9% (74/95). The mutation rates of p53 gene in NO, N1, N2 staged lung cancer were 22.6% (7/31), 44.2% (19/43) and 61.9%(13/21), respectively. The difference was statistically significant(P＜0.025). The 3 year survival rate in patients with p53 mutations was significantly lower than those without p53 mutations (P＜0.025).Conclusion　The location of p53 mutations in squamous cell carcinoma and adenocarcinoma of the lung were more commonly seen on exon 5 and exon 7. p53 mutations were associated with increased lymph nodes metastasis and reduced survival rate in squamous cell carcinoma and adenocarcinoma of the lung.

　　【Key words 】　Lung neoplasms　　Protein p53　　Genes, p53　　Mutation　　Prognosis

　　p53基因是人类肿瘤中突变率最高的抑癌基因，其在肺癌中的突变率超过了50%。p53基因的功能失活在肺癌的发生和发展过程中起着非常重要的作用。关于p53蛋白表达和突变与肺癌临床病理预后的关系存在不同的观点^［1～4］。我们共收集了95例肺癌的石蜡包埋组织及其详细的临床和病理资料，旨在探讨p53蛋白表达和基因突变与肺癌临床、病理和预后的关系。

材料和方法

　　一、标本及临床病理资料

　　收集湖北省肿瘤医院胸外科1988～1993年连续的原发肺腺癌和鳞癌石蜡标本95例，并整理详细的临床、病理及随访资料。根据WHO1982年有关肺癌的分类标准，对95例肺癌重新进行复诊和分化程度分级。根据1985年国际抗癌联盟(UICC)第四届肺癌会议对肺癌TNM分期修正标准进行TNM分期。对全部病例进行术后随访，随访时间36～72个月。

　　二、免疫组织化学

　　石蜡切片采用常规0.01 mol/L柠檬酸盐缓冲液微波抗原修复及LSAB法进行免疫组化(IHC)染色。一抗采用DAKO公司鼠抗人p53单克隆抗体DO7(M7001，工作浓度1∶150)。以肿瘤细胞胞核内出现棕黄色颗粒为阳性细胞，阳性细胞数在10%～25%为(+)；25%～50%为(++)；＞50%为(+++)。每次实验均设阳性及阴性对照：以肺癌组织表达阳性切片为阳性对照，以正常肺组织作阴性对照，以TBS替代一抗作空白对照。

　　三、聚合酶链反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)

　　用常规酚氯仿法进行DNA提取，

　　p53基因第5外显子引物序列为：5′TAC TCC CCT GCC CTC AAC AAG a3′5′CGC TAT CTG AGC AGC GCT CAT3′，5′TCT GTT CAC TTG TGC CCT gA3′5′CAA CCA GCC CTG TCG TCT CT3′　扩增片段长度分别为181 bp和191 bp。

　　第6外显子引物序列为：5′GAT TGC TCT TAG GTC TGG CCC CT3′　5′CAG aCC TCA GGC GGC TCA TAG G 3′　5′ACG ACG GGG CTG GTT GCC CA3′　5′CTC cCA GAG ACC CCA GTT GC3′　扩增片段长度分别为130 bp和201 bp。

　　第7外显子引物序列为：5′CTG GGT TGG CTC TGA CTG TAC CA 3′　5′TGA cCT GGA GTC TTC CAG TGT G 3′　5′ GGC CTC ATC TTG GGC CTG TG 3′　5′ CAG tGT GCA GGG TGG CAA GT 3′　扩增片段长度分别为119 bp和171 bp。

　　第8外显子引物序列为：5′ GTAGTGGTAATCTACTGGGACGGA 3′　5′CTCGCT tAG TGC TCCCTG GGG GC 3′　5′TTC CTA TCC TGA GTA GTG GT 3′　5′CTT CTT gTC CTG CTT GCT TA 3′　扩增片段长度分别为141 bp和174 bp。

　　PCR反应条件：预变性95℃ 2分钟后，95℃ 40秒，55℃ 40秒，72℃30秒，共35个循环后延伸72℃ 5分钟。反应完成后，取5 μl反应液用1.5%的琼脂糖电泳观察PCR产物的扩增情况，如在预期位置有清晰之扩增带，则可进行下一步的SSCP电泳。若扩增带很弱或无带，则采用巢式PCR(nested PCR)。SSCP电泳：10%聚丙烯酰胺胶(59∶1)、恒温12℃、50 V电泳12～15小时。结果判断：每次电泳都以正常肺组织扩增产物作对照，若同时电泳的肿瘤标本与正常相比出现条带的增多、减少或位置的变动即说明该样品存在基因突变。

结果

　　一、临床及病理资料分析

　　95例肺癌中，男84例，女11例。年龄最大者74岁，最小者25岁，平均年龄52.6岁。吸烟者67例(70.5%)；非吸烟者28例(29.5%)。瘤体大小：直径最大者9.5 cm、最小者2.5 cm，平均为5.4 cm。其中，鳞状细胞癌46例、腺癌49例。肿瘤分化程度：高分化(Ⅰ级)16例，中分化(Ⅱ级)42例，低分化(Ⅲ级)37例。TNM分期：Ⅰ期29例、Ⅱ期47例、Ⅲa期19例。所有鳞癌均进行常规术后放疗，腺癌则作常规化疗。全组病例的3年生存率为54.7%。

　　二、p53免疫组化检测结果及其与临床病理和预后的相关性

　　在正常或非肿瘤肺组织中p53蛋白免疫组化为阴性。p53蛋白定位于肿瘤细胞胞核内(图1，2)，p53免疫组化总阳性率为50.5%(48/95例)。鳞状细胞癌阳性率为56.5%、腺癌为44.9%。p53蛋白表达与肺癌淋巴结转移及3年生存期的关系见表1，显示p53蛋白阳性与肺癌患者的淋巴结转移状况和预后相关，即p53蛋白免疫组化阳性的肺癌患者淋巴结转移率高(P＜0.05)，3年生存率低(P＜0.025)。p53蛋白免疫组化阳性与患者的性别、年龄、肿瘤大小、吸烟史、组织学分类、分化程度和临床分期等无关。

表1　p53蛋白表达与肺癌淋巴结转移

　　及3年生存期的关系(例数)

表2　p53基因突变与肺癌淋巴结转移

　　及3年生存期的关系(例数)

　　图1　肺鳞状细胞癌Ⅱ级，p53免疫组化染色癌细胞阳性，p53蛋白阳性产物累积在细胞核上，间质阴性　LSAB法×200　图2　肺高分化腺癌，p53免疫组化染色癌细胞阳性，p53蛋白阳性产物累积在细胞核上，间质阴性　LSAB法×200

　　三、PCR-SSCP检测结果及其与临床病理预后的相关性

　　p53基因突变与肺癌淋巴结转移及3年生存期的关系见表2。

　　PCR-SSCP检测结果显示：p53基因突变广泛分布于第5～8外显子(图3)，共有39例标本被检出为

　　t：为肿瘤，N：正常对照；箭头所指为泳动变位(mobility shift)

　　图3　p53基因第6外显子的PCR-SSCP检测结果

　　阳性，总突变率41.1%(39/95例)。其中肺鳞癌突变率为47.8%(22/46例)；腺癌为34.7%(17/49例)。突变位于第5外显子者有15例，占38.5%；6外显子3例，占7.7%；7外显子13例，占33.3%；8外显子8例，占20.5%。N0、N1、N2期肺癌p53突变率分别为22.6%(7/31例)、44.2%(19/43例)、61.9%(13/21例)，差异有显著性(P＜0.025)；95例肺癌中，生存率低于3年组和高于3年组患者的p53突变率分别为51.9%(27/52例)、27.9%(12/43)，差异有显著性(P＜0.025)。p53突变与肺癌患者的预后和淋巴结转移呈负相关(P＜0.025)；而与肺癌患者的年龄、性别、肿瘤大小、病理类型、分化程度和临床分期无关。虽然吸烟者p53的突变率46.3%(31/67例)较非吸烟者28.6%(8/28例)高，但差异并无统计学意义(P＞0.05)。

　　四、免疫组化与PCR-SSCP检测结果的比较

　　PCR-SSCP检测与免疫组化染色阳性强度比较结果为：PCR-SSCP阳性中，p53免疫组化(-)：6例，(+)：8例，(++)：12例，(+++)：13例。PCR-SSCP阴性中，p53免疫组化(-)：41例，(+)：7例，(++)：5例，(+++)：3例。

　　在免疫组化阳性的48例中，PCR-SSCP阳性者有33例，而在p53蛋白阴性的47例中，PCR-SSCP阴性者有41例，两种方法检测的符合率为77.9%(74/95例)，与非同位素PCR-SSCP检测95例肺癌的p53第5～8外显子突变结果相比，用免疫组化检测p53突变的敏感性、假阴性率分别为66.8%(33/48例)和12.8%(6/47例)。PCR-SSCP检测阳性与免疫组化染色阳性强度呈正相关，并且大多数突变为免疫组化染色强阳性者(强阳性指免疫组化染色阳性细胞数在25%以上，P＜0.005)。

讨论

　　关于p53蛋白蓄积与临床病理和预后的相关性，国外已有较多报道，由于所用的抗体、阳性判断标准和病例选择等方面的差异造成了结论的不一致，大多数的研究结果认为如果检测出p53蛋白蓄积预示着肺癌患者肿瘤侵袭力强，预后差^{［3，5，6］}。也有少数报道认为其与预后无关^［2］，甚至认为p53蛋白呈阳性表达是肺癌患者预后好的指标^［4］。本研究结果支持国外大多数研究者的观点，即p53蛋白阳性的非小细胞性肺癌(NSCLC)患者更易发生淋巴结转移，预后差(P＜0.05)。p53蛋白阳性与肺癌患者的年龄、性别、肿瘤大小、病理类型、分化程度和临床分期无关。

　　本研究应用PCR-SSCP检测95例肺腺癌和鳞癌p53基因第5～8外显子的突变率为41.4%。p53基因突变广泛分布于其第5～8外显子，以突变位于第5外显子者为最多，共18例，其后依次是：第7外显子17例，第8外显子9例，第6外显子8例。组织学类型以鳞癌突变率较高，为47.8%，腺癌为34.7%，除肺腺癌突变率比Miller^［7］报道的稍高外，鳞癌稍低。Suzuki^［8］等报道p53基因突变与吸烟有相关性，我们的研究结果显示p53基因突变虽然在吸烟者中较多见但无统计学意义。伴有p53基因突变的肺癌患者更易发生局部淋巴结转移，预后差^{［1，6，9］}。但p53突变与年龄、性别、肿瘤大小、病理类型、分化程度、临床分期等因素无明显相关性。

　　免疫组化与非同位素PCR-SSCP检测95例肺癌的p53第5～8外显子突变结果相比，两种方法的符合率为77.9%(74/95例)，免疫组化的敏感性为66.8%(33/48例)，假阴性率为12.8%(6/47例)。PCR-SSCP阳性率比免疫组化低，其原因可能是：(1)位于5～8外显子以外的突变没有被检测；(2)免疫组化因MDM2等其它因素影响造成的假阳性率较高^［10］；(3)SSCP方法本身的敏感性只能达到90%左右^［11］。此外，p53基因突变与免疫组化染色强度呈正相关，检出突变的病例大多为免疫组化染色强阳性，提示在仅仅只进行了p53免疫组化检测时，如果呈强阳性的病例很可能伴有p53基因突变。

参考文献

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(收稿：1997-09-16　　修回：1998-03-30)