肺癌组织p16和Rb基因mRNA表达的双重原位杂交观察

临床与实验病理学杂志 2000年第3期第16卷 人体病理学

作者：苏长青　叶玉坤　王媛　汪栋　单祥年

单位：（南京八一医院全军肿瘤研究中心　210002）

关键词：肺肿瘤；p16基因；Rb基因；原位杂交

　　摘要　目的：研究p16和Rb基因在mRNA水平的表达及其与肺癌的关系。方法：制备p16和Rb基因cDNA探针，采用双重原位杂交的方法，对89例肺癌和正常肺组织进行了p16和Rb基因mRNA表达的定位研究。结果：小细胞肺癌p16 mRNA阳性表达率高达82.4%(14/17)，而非小细胞肺癌阳性率为45.8%(33/72)，两者差异有显著性(P＜0.05)。非小细胞肺癌Rb mRNA阳性表达率为81.9%(59/72)，而小细胞肺癌阳性率仅5.9%(1/17)，两者差异有高度显著性(P＜0.01)。两种基因在蛋白水平和mRNA水平的表达基本相符。结论：p16基因mRNA表达的丢失主要发生于非小细胞肺癌，Rb基因表达的丢失主要发生于小细胞肺癌。在翻译水平上也存在着引起p16和Rb基因蛋白失活的可能机制。

　　中图分类号　R734.2　　文献标识码　A

　　文章编号　1001-7399(2000)03-0180-04

Observation of p16 and Rb gene mRNA expressions in lung cancers by in situ hybridization

Su Changqing　Ye Yukun　Wang Yuan　Wang Dong　 Shan Xiangnian

　　（Central Laboratory, Nanjing 81st Hospital of PLA, Nanjing　210002）

　　ABSTRACT　Purpose　To study p16 and Rb gene mRNA expressions and their relationships to lung cancer. Methods　Preparation of p16 and Rb cDNA probes and in situ hybridization were applicated to locate p16 and Rb mRNA expressions in 89 cases of lung cancers and lung tissues. Results　The positive expression rate of p16 mRNA in small cell lung cancers was 82.4%(14/17), but 45.8%(33/72) in non-small cell lung cancers. The positive expression rate of Rb mRNA in non-small cell lung cancers was 81.9%(59/72), but only 5.9%(1/17) in small cell lung cancers. The expressions of these two genes at protein and mRNA levels fundamentally corresponded with each other. Conclusion　The loss of p16 mRNA expression mainly takes place in non-small cell lung cancers, and loss of Rb mRNA expressions mainly takes place in small cell lung cancers. Maybe there is a mechanism at gene translation level which leads to the inactivation of p16 or Rb gene protein.

　　KEY WORDS　lung neoplasms; p16 gene; Rb gene; in situ hybridization

　　细胞周期的调控依赖于一系列正向和负向周期蛋白的精密调节，使细胞处于增殖和抑制的动态平衡之中。抑癌基因产物是一类重要的负向周期调控因子，抑癌基因变异的结果是，细胞失去控制，进入旺盛的增殖转化过程中。由cyclin D1、CDK4、Rb和p16组成的调节环路是细胞从G₁期进入S期的重要限速步骤^〔1，2〕。p16基因蛋白与cyclin D1竞争结合CDK4，抑制CDK4的激酶活性，阻止Rb基因蛋白的磷酸化使之呈活性状态，保持与转录因子E2F的结合，从而发挥抑制细胞增殖的作用。我们在以往的实验中已经对肺癌组织p16和Rb基因的蛋白表达进行了研究^〔3〕，现采用双重原位杂交方法，进一步观察同一组病例基因mRNA的表达，探讨p16和Rb基因失活的机制及其与肺癌发生发展的关系。

　　1　材料和方法

　　1.1　病例资料　89例肺癌标本取自南京八一医院、南京胸科医院和江苏省肿瘤防治研究所1997年3月～1998年8月临床手术的病人。经常规病理诊断，非小细胞肺癌(NSCLC)72例(包括鳞癌39例，腺癌31例，腺鳞癌2例)，小细胞肺癌(SCLC)17例。本组病例经免疫组化检测^〔3〕，正常肺组织无p16基因蛋白的丢失，Rb基因蛋白丢失率仅4.5%(4/89)。肺癌组织p16蛋白总丢失率为47.2%(42/89)，其中NSCLC的p16蛋白丢失率达56.9%(41/72)。肺癌中Rb基因蛋白总丢失率31.5%(28/89)，其中发生于SCLC者达88.2%(15/17)。

　　1.2　p16基因克隆及探针制备

　　1.2.1　总RNA的制备　取3 g人正常肺组织，异硫氰酸胍法提取组织总RNA，溶于50 μl ddH₂O-DEPC，电泳检测28S、18S RNA。

　　1.2.2　逆转录PCR　根据p16基因cDNA序列设计引物，上游5′ GGAATTCCATGGAGCCTTCGG-CT 3′，下游5′ TGGATCCTTCAATCGGGGATGT 3′，由上海生工合成，逆转录试剂盒为Promega产品。取10 μl总RNA(4 μg)，依次加入2 μl 10×RT缓冲液，1 μl Oligo dT(0.2 μg)，2 μl 10 mmol/L dNTP混合物，0.5 μl RNasin,2 μl逆转录酶(50 U)，3.5 μl H₂O,42℃ 30 min,95℃ 5 min，冰中冷却。在逆转录反应液中加4 μl 25 mmol/L MgCl₂,8 μl 10×RT缓冲液，引物各50 pmol/L,1 μl Taq酶(5U)，用H₂O补充到100 μl。94℃ 20 s,55℃ 20 s，72℃ 30 s，35个循环，72℃延伸5 min。

　　1.2.3　p16探针的制备　1.5%低熔点琼脂糖凝胶电泳回收PCR片段(0.5 kb)，连接克隆到pAdCMV质粒(Promega)的Hpa Ⅰ(平头末端)位点中。大量制备pAdCMV-p16质粒，Cla Ⅰ/Hind Ⅲ酶切鉴定。将上述体系置于37℃水浴2 h，1.5%的低熔点琼脂糖电泳，通过与1 kb分子量标记的比较回收p16条带。然后用酚∶氯仿∶异戊醇抽提，加入1/10体积的3 mol/L NaAc，2倍体积的无水乙醇，-20℃过夜。4℃离心，沉淀溶于50 μl水中。加入15 μl纯化过的含有p16基因片段的溶液，2 μl六核苷酸混合物，沸水煮10 min。加入2 μl dNTP混合物(含Dig-11-dUTP)，1 μl Klenow酶，混匀后37℃水浴过夜。加入2 μl 0.2 mol/L EDTA pH8.0，1/10体积的3 mol/L NaAc,2倍体积的预冷无水乙醇，混匀后-20℃过夜。4℃离心15 min，溶于50 μl TE缓冲液中。按Dig标记检测试剂盒说明进行探针的检测，探针浓度＞10 ng/L。Dig标记检测试剂盒为Boehringer Mannheim公司产品，各种限制性内切酶购自MBI公司，其余试剂均为国产分析纯。

　　1.3　Rb cDNA探针的制备　含人Rb基因部分cDNA序列(长约3.1 kb)的质粒pAbT9214(Calbiochem)，单向克隆位点EcoR Ⅰ/Hind Ⅲ。按上述标记p16探针同样的方法进行酶切回收Rb cDNA片段、随机引物标记及探针检测，探针浓度＞10 μg/L。Bio标记检测试剂盒为Maxim公司产品。

　　1.4　p16和Rb基因mRNA双重原位杂交　参考Dig和Bio标记检测试剂盒的说明略加修改进行双重原位杂交。在肿瘤、边缘正常肺取材，冷冻切片经蔗糖PBS洗，300 mg/L蛋白酶K消化，37℃ 15 min，蔗糖PBS洗，4%多聚甲醛固定5 min，脱水干燥。滴加预杂交液(50%去离子甲酰胺，2×SSC，2×Dehardt液，10%硫酸葡聚糖，4×10⁷ U/L RNasin,0.5 g/L鲑精DNA，0.5 g/L酵母tRNA)，37℃ 60 min。以预杂交液配制杂交液，两探针浓度为0.5 mg/L，加到切片上，95℃ 60 min，44℃杂交过夜。2×SSC(含50%去离子甲酰胺)洗，封闭液室温作用10 min。滴加碱性磷酸酶标记的抗Dig抗体(1∶500)和辣根过氧化物酶标记的链菌素亲生物素(1∶100)混合液，37℃孵育60 min，2×SSC和0.05 mol/L Tris-HCl (pH7.2)洗。切片先用过氧化物酶底物3-氨基-9-乙基-卡巴唑(AEC)在pH7.2条件下显色，阳性产物呈红色。0.05 mol/L Tris-HCl pH9.5(含0.1 mol/L NaCl,1 mmol/L MgCl₂)洗。再与碱性磷酸酶底物NBT/BCIP在pH9.5条件下作用显色，阳性产物呈蓝色。封片后镜检。

　　1.5　结果判断　采用双盲法对每张切片在高倍镜(×400)下计数10个视野。以染色强度和阳性细胞比例分别计分，两项得分相加，判断结果。以χ²检验进行统计学处理。

　　2　结果

　　2.1　p16和Rb基因mRNA的原位杂交　正常肺组织p16 mRNA阳性产物呈蓝色，分布于多种细胞的胞浆胞核中，以胞浆为主，阳性率为96.9%(86/89)。Rb mRNA阳性产物呈红色，见于粘膜上皮、肺泡上皮及炎症细胞胞浆中，阳性率为94.4%(84/89)。肺癌组织p16、Rb基因mRNA多数共同阳性表达(图1)。p16 mRNA阳性表达率以SCLC较高(图2)，达82.4%(14/17)，而NSCLC阳性率为45.8%(33/72)，两者差异有显著性(P＜0.05)。Rb mRNA阳性表达率以NSCLC较高(图3)，达81.9%(59/72)，而SCLC阳性率为5.9%(1/17)，两者差异有高度显著性(P＜0.01)。

　　2.2　p16和Rb基因蛋白水平和mRNA水平表达的一致性　p16、Rb基因在蛋白和mRNA两种水平上的表达，结果基本相符(表1)。

表1　p16、Rb基因蛋白和mRNA表达的一致性

图1　肺鳞癌细胞p16、Rb基因mRNA共同阳性表达。×200

2　小细胞肺癌p16 mRNA阳性，Rb mRNA阴性。×200

3　非小细胞肺癌p16 mRNA阴性，Rb mRNA阳性。×200

　　3　讨论

　　肿瘤细胞的恶性转化由一系列细胞周期调节蛋白基因的遗传性改变引起。cyclin D1和CDK4的过度表达见于人类多种肿瘤中，是促进细胞由G₁期向S期推进的重要因素^〔4，5〕，而p16基因蛋白则是cyclin D1/CDK4的抑制因子，它在很多恶性肿瘤及其细胞系中呈失活状态^〔6，7〕。这些因素的改变最终都是通过调节Rb蛋白的磷酸化状态，控制细胞周期的演变。国外研究发现，很多肿瘤中常见p16和Rb基因蛋白的失活，两者的表达在某些组织学类型的肿瘤中呈反向关系^〔8，9〕。p16或Rb蛋白的失活，导致Rb介导的细胞生长抑制被解除，因而促进细胞进入不可抑制的增殖之中，引发肿瘤的发生。目前的研究多集中于DNA水平，认为基因的缺失、突变使基因不能转录为mRNA，是基因失活的主要原因。由于执行生物功能的是基因产物，而从基因转录到蛋白翻译任一环节的失调，都可能导致蛋白的失活，那么，从mRNA翻译成蛋白质这一环节是否也存在影响p16或Rb蛋白活性的可能机制呢?

　　采用原位杂交法对肺癌组织p16和Rb基因进行mRNA水平表达的定位研究，发现p16和Rb基因mRNA水平的表达与蛋白水平的表达基本一致，符合率在90%左右。89例肺癌中仅发现2例SCLC p16蛋白阳性而p16 mRNA阴性，NSCLC和SCLC各有1例Rb基因蛋白阳性而Rb mRNA阴性，这可能与原位杂交的方法不成熟造成mRNA的假阴性有关，也可能是mRNA降解的缘故。有2例NSCLC p16基因蛋白阴性而p16 mRNA阳性，1例NSCL Rb蛋白阴性而Rb mRNA阳性。目前检测基因蛋白表达的免疫组化方法十分成熟，在排除方法学的因素以外，我们有理由相信，在翻译水平上，即由mRNA到蛋白质的过程中，也存在着引起p16和Rb基因蛋白表达丢失的可能机制，但所占比例很低。在同一例肺癌组织中，p16或Rb基因在蛋白水平和mRNA水平上的表达均存在异质性，即一部分细胞可以呈阳性表达，另一部分呈阴性表达，说明肺癌的发生并不是单克隆的，不同癌细胞亚群的遗传学改变也有明显差异，其发生机制有可能不同。

　　双重原位杂交方法的建立，可以使我们更直接地定位观察肿瘤细胞p16和Rb基因mRNA的表达，并比较分析两者的相关性。由实验结果可以看出，p16基因的丢失主要发生于NSCLC，而Rb基因的表达丢失主要发生于SCLC，结果与文献^〔10〕相同。p16和Rb基因在NSCLC和SCLC中表达的反平行关系，说明两种类型肺癌的发生发展与p16-cyclin D1-CDK4-Rb同一调节环路的不同环节的调控失常有关。p16蛋白的失表达，导致cyclin D1/CDK4活性升高，Rb蛋白磷酸化失活并释放出转录因子，促进细胞增殖，这是NSCLC发生的可能机制。Rb蛋白的失表达，使上述调节环路在最终的关键环节中断，无法发挥其负调控细胞生长的作用，这可能与SCLC的发生发展密切相关。

　　基金项目：国家“九五”重点科技攻关项目(No 969060118)、国家自然科学基金(No 39670714)资助项目

　　作者简介：苏长青，男，34岁，博士，副主任医师。从事肿瘤分子生物学研究

　　单祥年，男，60岁，博士生导师，教授。从事细胞分子遗传学研究

　　参考文献

　　1，Herman JG, Civin CI, Issa JPJ et al. Distinct patterns of inactivation of p15^INK4B and p16^INK4A characterize the major types of hematological malignancies. Cancer Res,1997;57:837

　　2，苏长青，李淑锋，叶玉坤等.p16和Rb基因蛋白在肺癌中的表达.临床与实验病理学杂志，1999；15：199

　　3，Dreyling MH, Bullinger L, Ott G et al. Alterations of the cyclin D1/p16-pRb pathway in mantle cell lymphoma. Cancer Res,1997;57:4608

　　4，Bartkova J, Lukas J, Gudberg P et al. The p16-cyclin D/CDK4-pRb pathway as a functional unit frequently altered in melanoma pathogenesis. Cancer Res,1996;56:5475

　　5，Michalides R, Van Veelen N, Hart A et al. Overexpression of cyclin D1 correlates with recurrence in a group of forty-seven operable squamous cell carcinomas of the head and neck. Cancer,1995;55:975

　　6，Liggett WH Jr, Sidransky D. Role of the p16 tumor suppressor gene in cancer. J Clin Oncol,1998;16:1197

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　　8，Geradts J, Kratzke PA, Niehans G et al. Immunohistochemical detection of the cyclin-dependent kinase inhibitor 2/multiple tumor suppressor gene 1(CDKN2/MTS1)product p16^INK4a in archival human solid tumors:correlation with retinoblastoma protein expression. Cancer Res,1995;55:6006

　　9，Kratzke RA, Otterson GA, Lincoln CE et al. Immunohistochemical analysis of the p16^INK4a cyclin-dependent kinase inhibitor in malignant mesothelioma. J Natl Cancer Inst,1995;87:1870

　　10，Kratzke RA, Greatens TM, Rubins JB et al. Rb and p16^INK4a expression in resected non-small cell lung tumors. Cancer Res,1996;56:3415

收稿日期：1999-08-03

　　修回日期：1999-10-08