化痰散结方含药血清诱导人肺癌细胞凋亡的机理研究

北京中医药大学学报 1999年第5期第22卷 中医药实验研究

作者：杨勤建　涂晋文

单位：湖北中医学院　湖北430061

关键词：化痰散结方；血清药理学；肺癌细胞株；细胞凋亡

　　摘要：为探讨中药化痰散结方诱导人肺癌细胞(SPC-A1)凋亡的作用及其对正常人胚肺细胞的毒性作用，通过血清药理学方法，选择不同浓度的含药兔血清与人肺癌细胞共同孵育处理，并以正常人胚肺细胞(HEL)作对照。结果：人肺癌细胞经含中药兔血清作用，由贴壁生长而逐渐脱落，外形变圆，体积缩小，折光性增强；荧光镜下可见细胞核破碎，裂解为大小不等的凋亡小体；流式细胞仪检测显现典型的细胞凋亡峰，以5％含药血清作用48 h凋亡峰最为明显，凋亡率为42.8％；出现S期细胞阻滞；而该含药血清对人胚肺细胞无诱导凋亡作用。化痰散结方通过血清药理学方法诱导人肺癌细胞的凋亡，可能是其抗肿瘤的分子学机制之一。

Research on the Mechanism of Induced Apoptosis of SPC-A1

Yang Qinjian（杨勤建）

　　(Hubei College of Traditional Chinese Medicine, Hubei 430061)

　　ABSTRACT: Objective: Approach to the effect of composed Chinese drug 892 on inducing the apoptosis of SPC-A1. Methods: According to the basic TCM theory, the pathologic characteristic of lung cancer is stagnation of phlegm and turbid qi. Drug 892, composed of Banxia (Rhizoma Pinelliae), Tiannanxing (Rhizoma Arisaematis), and Sanqi(Radix Notoginseng). After incubating SPC-A1 and drug-bearing rabit serum which at different concentration with serologic pharmacological method, observed and detected the growth and apoptosis of cells, cell cycle and apoptosis rate. Results: By the action of drug-bearing rabit serum, SPC-A1 grew against the wall and then peeled off gradually; fluorescence microscope showed the nucleus broke into pieces, and cell split into apoptosis bodies in different size; FCM showed a typical peak of apoptosis, which was most obvious after 48 hours' action with 5% drug-bearing rabit serum at the rate of 42.82%. Conclusion: One of the antineoplastic molecular mechanism of composed Chinese drug 892 may be its effect on inducing the apoptosis of SPC-A1 by serologic pharmacological method.

　　KEY WORDS: Drug 892/Chinese drug; Serologic pharmacological test; SPC-A1; Apoptosis

　　细胞凋亡与肿瘤的发生、发展密切相关，诱导肿瘤细胞凋亡将是寻找抗肿瘤药物的新靶点^［1］。本实验在化痰散结方(原名892号药液)具有提高荷癌小鼠的NK细胞活性和血清TNF含量作用以及可抑制肺腺癌细胞生长的基础上^［2］，又通过血清药理学方法，以观察其诱导人肺癌细胞(SPC-Al)凋亡的作用。

　　1　材料与方法

　　1.1　动物和药物

　　纯种新西兰家兔，雄性，体重2.5～3 kg，由湖北省医药工业研究所提供。人肺癌细胞株(SPC-Al)、人胚肺细胞(HEL)由武汉大学中国典型培养物保藏中心提供。化痰散结方，由半夏、天南星、马钱子、三七等中药组成，生药由湖北省药材公司饮片厂提供，制成含生药1 g/mL的浸膏。DMEM培养液、胎牛血清、胰酶，购自美国Gibco公司；二苯酰胺Hoechst　33258、硫柳汞thsmertsol，购自美国Sigma公司。DAPI、SR101染色剂，由德国Partec公司提供。

　　1.2　仪器

　　倒置相差显微镜、荧光显微镜BH-213(日本O1ympus公司)，流式细胞仪PAS－ⅢⅠ(德国Partec公司)，CO₂培养箱DODEL2300型(美国Shellab公司)。

　　1.3　含药血清制备

　　选用纯种雄性新西兰家兔5只，每日给予化痰散结方药液浸膏7 g/kg灌胃，10 d后，于最后1次灌药后1 h(灌药前禁食不禁水12 h)，乙醚麻醉，颈动脉采血，无菌分离血清，经56℃，30 min处理后，置-20℃冰箱备用。

　　1.4　含药血清药物成分的定性检测

　　为了了解药物灌胃后是否经胃肠吸收进入血液，取化痰散结方中代表性成分马钱子(含士的宁)作含药血清定性检测。取含药血清样本2份，空白兔血清样本1份，各50 mL，分别用25O mL甲醇超声提取30 min，离心，收集溶剂，蒸干，用1 mL甲醇溶解；化痰散结方制剂对照组，取制剂20 mL，用氯仿提取2次，每次20 mL，提取液回收溶剂，蒸干，溶解于1 mL甲醇中；马钱子对照药：取马钱子1 g破碎，用20 mL甲醇冷浸48 h，过滤，回收溶剂，蒸干，溶解于1 mL甲醇中。用硅胶G加入9 mL 0.5％CMC-Na溶液，研匀，均匀铺在洁净的10　cm×20　cm玻璃板上，晾干，于105℃活化30　min，置干燥器中冷却备用。分别取含药血清样1、样2，空白兔血清、化痰散结方制剂、马钱子对照药材供试液各10 μL，点于同一块备好的硅胶G薄层板上；向双槽层析缸的一槽中加入20 mL展开剂(苯、乙酸乙酯、二乙胺比例为1∶2∶0.05)，另一槽中加10 mL浓氨水，然后将点好样的薄层板置于展剂槽中，盖好层析缸盖，上行展开，展距10 cm，取出晾干，喷改良的Dragendorff试剂显色。

　　1.5　人肺癌细胞培养

　　将传代的人肺癌细胞(SPC-Al)接种于含1％青、链霉素和10％胎牛血清的DMEM培养液中(下同)，细胞浓度为2×10⁸　L^－1，置于含5％CO₂、37℃温度培养箱中培养。培养24　h至细胞生长旺盛后，去培养液，加入含药血清5％、10％浓度的培养液各5　mL(另设无含药血清对照组、正常人胚肺细胞＋含药血清5％、10％浓度培养液组)，置培养箱中培养24 h，去含药血清培养液，再加入不含药血清的DMEM培养液分别培养24、48 h(简称5％24 h、10％24 h、5％48 h、10％48 h)，将培养皿在倒置相差显微镜下作细胞生长状态的观察。

　　1.6　荧光染色细胞的制备

　　将培养24、48 h的细胞上清液收集；用胰酶消化培养皿的贴壁细胞，将二者细胞培养液收集合并，离心去上清液。一部分加入含甲醇、冰乙酸的固定液固定，反复2次，每次5 min，离心去固定液后，取细胞沉淀液玻璃滴片，干燥，加二苯酰胺荧光液染色1 h(避光)，三蒸水反复冲洗3次，置常温下自然干燥，甘油封片，O1ympus荧光显微镜(10×20倍)下作细胞凋亡的形态学观察。

　　1.7　流式细胞仪检测细胞的制备

　　将另一部分细胞沉淀液用PBS冲洗2次，在震荡状态下缓慢滴入75％乙醇2 mL左右，过夜，用DAPI、SR101染色剂双染色30 min，滤网过滤，作流式细胞仪检测。每份样品测10000个以上细胞。

　　2　结果

　　2.1　含药血清检测

　　含药血清样1、样2及制剂样品色谱，经与马钱子对照药材色谱比较，在相应的位置上显现出3个相同的棕黄色斑点；空白兔血清样品则无棕黄色斑点显示，表明兔血清中含有化痰散结方的某些药物成分。

　　2.2　人肺癌细胞、人胚肺细胞生长形态观察

　　经含药血清处理24 h后，再加培养液培养12～24 h，即可见细胞由贴壁而脱落，浮悬于培养液中，细胞体积缩小、变圆，核颜色加深，折光性增强，24～48 h的脱落细胞更加增多；无含药血清培养液培养的癌细胞贴壁生长，几乎无脱落，胞浆饱满，舒展生长，相邻细胞生长融合成片。正常人胚肺细胞经含药血清处理24～48 h，细胞仍贴壁生长，培养液中未见浮悬细胞，胞浆饱满，生长旺盛。

　　2.3　荧光染色细胞核形态

　　荧光显微镜下见含药血清处理的人肺癌细胞细胞核在24、48 h时间段中均有破裂，呈大小不等、形态不规则的碎片或呈梅花状，此为典型的细胞凋亡形态(见图1)；含药血清处理的人胚肺细胞和无含药血清培养的人肺癌细胞均完整，未见有凋亡形态。

图1　5％含药血清处理24 h的人肺癌细胞凋亡形态(10×20倍)

　　2.4　流式细胞仪检测凋亡细胞

　　不同含药血清浓度和不同时间处理的人肺癌细胞均有细胞凋亡，其中以5％48 h组的凋亡峰(AP峰)在DNA组方图上显示最为明显(见图2)，凋亡率达42.82％；而无含药血清处理的人肺癌细胞组无凋亡峰(见图3)。

图2　5％含药血清处理48 h的人肺癌细胞，

　　流式细胞仪检测直方图，可见一凋亡峰(AP峰)

图3　无含药血清处理48 h的人肺癌细胞，

　　流式细胞仪检测直方图，无凋亡峰

　　2.5　细胞周期分布分析

　　从流式细胞仪检测分析可知，以含药血清处理的人肺癌细胞，主要表现为S期细胞的百分比增高，G2/M期细胞的百分比下降，出现明显的细胞S期阻滞。

　　3　讨论

　　近年来，有研究证明^［3］：部分中药提取物能诱导肿瘤细胞凋亡，如紫杉醇、榄香烯乳、氧化砷、大蒜油等，但均为药物在体外与细胞直接作用，其结果不能完全说明中药服用后在体内的药物作用效果，更不能等同于中药复方的复杂作用。日本学者在对中药的研究中，建立了血清药理学的实验方法^［4］，这种方法排除了在体外实验过程中药物与细胞直接作用时某些因素的干扰，较接近药物在体内环境中产生的药理效应的真实过程。但迄今尚鲜见中药复方或单味药物通过血清药理学方法诱导肿瘤细胞凋亡的报道。本实验选用具有化痰散结、活血化瘀等作用的生半夏、天南星、三七、马钱子等组成复方“化痰散结方”，通过血清药理学方法成功地诱导了人肺癌细胞的凋亡，从形态学和流式细胞仪检测均呈现明显的凋亡特征。表明中药复方也具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用。而该含药血清对正常人胚肺细胞无诱导凋亡作用。

　　中药复方成分复杂，血清中是否含有某些药物的成分是判断该药物诱导细胞凋亡的关键。通过薄层检验显色结果证明兔血清中含有化痰散结方的某些药物成分。提示该含药血清诱导的人肺癌细胞凋亡与中药复方有密切关系。

　　化痰散结方是根据肿瘤临床所见多为“痰瘀浊气凝结”的病理特点而组方选药的，实验结果表明其抗肿瘤作用与诱导肿瘤细胞凋亡有关，并首次发现半夏、天南星等药物组方具有诱导人肺癌细胞凋亡的作用。但复方中药的作用不等同于单味中药作用的叠加，其诱导凋亡的药物成分为何?是药物直接作用还是通过提高NK细胞活性或TNF含量而间接诱导肿瘤细胞凋亡，或是其它因素作用?尚有待于深入研究。

　　本实验得到武汉大学中国典型培养物保藏中心郑从义教授、屈三甫讲师，湖北省肿瘤医院肿瘤研究所杨峰、贺兰湘、周济兰等医师的大力协助，在此表示衷心的感谢!

　　作者简介:杨勤建，男，42岁，医学博士，副研究员

　　参考文献

　　1　黄　镜，孙　燕.肿瘤药物治疗的新靶点：凋亡.中国新药杂志，1997，6(6)：412～413

　　2　杨勤建，雷良蔚，潘希雄，等.892号药液治疗支气管肺癌的临床和实验研究.中国中西医结合外科杂志，1998，4(2)：68～69

　　3　杨勤建.中药诱导肿瘤细胞凋亡的研究进展.湖北中医杂志，1998，20(1)：53～55

　　4　张君豪，陈可冀.血清药理学在中药及复方研究中应用的评价.中国中西医结合杂志，1996，16(3)：131

收稿日期：1998-11-03