肿瘤转移抑制基因nm23-H₁蛋白在肺癌中的表达

广州中医药大学学报 1999年第1期第16卷 新学科与新技术

作者：张良　万豫尧　朱明　张尚福　成娘

单位：张良　万豫尧　朱明（广州中医药大学第二附属医院外科，广州510120）；张尚福　成娘（华西医科大学第一附属医院病理科，成都610041）

关键词：肺肿瘤；病理学；基因，nm23-H₁；基因，抑制，肿瘤；肿瘤转移；淋巴转移

　　摘要：为了解nm23-H₁基因在肺癌中的表达及与肺癌淋巴转移的关系，探讨其对肺癌淋巴结转移的抑制作用，对 78 例肺癌存档石蜡块进行重新切片，采用nm23-H₁单克隆抗体进行免疫组化染色(SP法)。结果：nm23-H₁蛋白表达与肺癌组织类型和淋巴结转移无关(P＞0.05)，而与肺癌细胞分化及发生有关(P＜0.01)。结果提示 nm23-H₁ 基因对肺癌的形成有重要作用，在肺癌中nm23-H₁基因不具有肿瘤转移抑制功能。

　　中图分类号：R734.2　　　文献标识码：A

　　文章编号：1007-3213(1999)01-0069-03

Expression of Tumor Metastasis-Suppressor Gene nm23-H₁

　　Protein in Lung Carcinoma

ZHANG Liang　WAN Yu-yao　ZHU Ming

　　(Dept. of Surgery, the Second Affiliated Hospital,Guangzhou University of TCM,Guangzhou 510120，China)

　　ZHANG Shang-fu　CHENG Liang

　　(Dept. of Pathology, the First Affiliated Hospital,West China University of Medical Sciences,Chengdu 610041，China)

　　abstract:To study the relationship between expression of gene nm23-H₁ protein and lymph node metastasis in lung carcinoma, 78 paraffin-embedded specimens of lung cancer were tested by immunohistochemical technology. The results showed that expression of gene nm23-H₁ protein was not related to histological types of lung carcinoma and lymph node metastasis (P＞0.05),but related to the formation of lung carcinoma and its tumor differentiation (P＜0.01).It is concluded that gene nm23-H₁ plays an important role in tumorigenesis and exerts no inhibitory effect on the metastasis of lung carcinoma.

　　Key words:LUNG NEOPLASMS/pathology;　@GENE nm23-H₁;　GENES,SUPPRESSOR, TUMOR;

　　NEOPLASM METASTASIS;　LYMPHATIC METASTASIS

　　自从nm23基因发现以来，不断有nm23与转移相关的研究报道。nm23表达产物为二磷酸核苷酸激酶(NDPK)，其与肺癌的关系尚无定论，我们以抗nm23-H₁蛋白特异性单克隆抗体，应用SP免疫组化技术，研究肺癌nm23-H₁基因蛋白表达及其与肺癌淋巴结转移的关系。

　　1　材料和方法

　　1.1　标本

　　病例选自华西医科大学第一附属医院1988～1995年手术切除石蜡包埋的肺癌标本共78例，其中磷癌42例，腺癌36例，所有病例均经病理学诊断证实。

　　1.2　方法

　　采用链菌素亲生物素—过氧化物酶免疫组织化学方法(SP法)，nm23-H₁单克隆抗体和试剂盒均为美国Zymed公司产品(购自北京中山生物公司)。步骤是：(1)5 μm石蜡切片裱于有乳胶的清洁玻片上，孵箱内60℃2 h，37℃ 12 h。(2)常规苯脱蜡，梯度洒精水化。(3)0.3%H₂O₂甲醇液处理30 min，充分水洗，经PBS洗1次。(4)微波处理15 min。(5)2%羊血清覆盖组织，37℃湿盒内处理10 min。(6)直接加单克隆抗体(Zymed、inc,1∶30)，37℃湿盒内处理 1 h。(7)PBS洗 10 min。(8)滴加第二抗体(生物素化羊抗鼠 IgG1∶200)，37℃湿盒内处理 30 min。 (9)PBS 洗 10 min。(10)滴加 SP 复合物。(11)PBS 洗 10 min。(12)DAB显色。(13)Harris 苏木素复染。(14)脱水，透明，封固。

　　对照：以PBS置换一抗作阴性对照，用已知阳性切片作阳性对照。

　　1.3　结果观察及判断

　　染色阳性信号为棕黄色。至少数 3 个高倍视野按顺序计数共300个肿瘤细胞，瘤周组织(正常上皮组织、粘液腺、浆液腺上皮)细胞用同样方法计数，根据细胞浆显色定为：(1)阴性(-)：无显色或显色细胞＜25%；(2)阳性(+)：26%～49%细胞显色；(3)强阳性(++)：50%(含50%)以上细胞显色。

　　1.4　统计学处理

　　对阳性结果作卡方检验或确切概率检验。

　　2　结果

　　2.1　肺癌及癌旁组织nm23-H₁蛋白表达

　　表1示肺癌nm23-H₁蛋白表达总阳性率为60.3%(47/78)，其中鳞癌nm23-H₁蛋白表达阳性率为59.5%，腺癌为 61.1%，后两者比较差异无显著性(P＞0.05)。无论鳞癌还是腺癌，nm23-H₁蛋白表达阳性率均明显高于其癌旁组织，差异有显著意义(P＜0.01)。在肺癌组织中nm23-H₁蛋白分布于肿瘤细胞浆，呈弥漫或颗粒性着色，未见细胞核或细胞膜着色(图1)。癌旁正常支气管可见少许粘膜上皮细胞、粘液腺、浆液腺上皮细胞，染色细胞数很少超过25%。

图1　肺腺癌细胞nm23-H₁蛋白呈阳性表达(SP×400)

表1　肺癌及癌旁 nm23-H₁蛋白表达

　　2.2　nm23-H₁蛋白表达与肺癌组织分化程度的关系

　　表2示低分化肺癌nm23-H₁蛋白表达阳性率高于中、高分化肺癌，差异有显著意义(P＜0.01)。

表2　nm23-H₁蛋白表达与肺癌组织分化程度的关系

　　2.3　nm23-H₁蛋白表达与肺癌淋巴结转移的关系

　　表3示不伴有和伴有淋巴转移肺癌nm23-H₁蛋白表达阳性率为 58.3%(21/36)和 61.9%(26/42)，差异无显著性(P＞0.05) 。无论鳞癌还是腺癌，其伴有淋巴结转移癌组织与不伴有淋巴结转移癌组织相比，nm23-H₁蛋白表达阳性率无显著性差异(P＞0.05)。

表3　nm23-H₁蛋白表达与肺癌淋巴结转移的关系

　　3　讨论　　nm23基因是1988年Steeg等^［1］从 7 株具有不同转移潜力的K-1735 黑色素瘤细胞株中用消减杂交法克隆出来的。进一步研究证明，人类基因组中存在两个nm23基因，即nm23-H₁和nm23-H₂。它们是两个独立的基因，受不同系统调控，可能具有不同的生物作用。nm23-H₁定位于人 17 号染色体 p11～q11 间，编码产物为 17KD蛋白，具有核苷酸二磷酸激酶(NDPK)作用。该基因抑制肿瘤转移的机制不清楚，可能通过影响细胞内微管的聚合(或解聚)和G蛋白介导的信号传导而参与肿瘤的发生、发展等^［2］。

　　肺癌是人类常见的肿瘤之一，其转移机制的研究引人注目。国内曾有用nm23多克隆抗体研究肺癌中nm23蛋白表达的报道^［3］。nm23多克隆抗体同单克隆抗体相比，多抗同时显示nm23-H₁、nm23-H₂蛋白及其他非nm23的NDPK，而单抗只与nm23蛋白反应，具有特异性，能排除其他非特异干扰，真正反应nm23蛋白表达。我们用nm23-H₁蛋白单克隆抗体研究78例肺癌组织中 nm23-H₁蛋白表达情况。结果显示，nm23-H₁蛋白在肺癌中有较高的表达，总阳性率为60.3%，肺鳞癌同腺癌相比，nm23-H₁蛋白表达无显著性差异(P＞0.05)。雷文冬等^［4］用nm23多克隆抗体研究发现肺腺癌nm23蛋白表达阳性率高于肺鳞癌，这种差异可能是NDPK/nm23-H₂在不同类型的肺癌中表达不同所致。此外，nm23-H₁蛋白表达在低分化癌高于中、高分化癌(P＜0.01)，无论是鳞癌还是腺癌，nm23-H₁蛋白表达均明显高于癌旁组织，差异有显著意义(P＜0.01)，同Engel等^［5］对肺鳞癌的研究结果一致，表明nm23-H₁基因在肺癌的分化和发生中起着重要作用。TuKunaga等^［6］对乳腺癌研究表明，130例乳腺癌中淋巴结转移组其nm23-H₁蛋白表达阳性率为39%，无转移组阳性率为79%，差异具有显著意义，nm23-H₁表达同淋巴结转移呈负相关。对鼻咽癌、食管癌、肝细胞肝癌的研究也得出了相似的结果^［7～9］。本研究显示无论是鳞癌还是腺癌，nm23-H₁蛋白表达与淋巴结转移无关(P＞0.05)，与Higashiyama等^［10］用多克隆抗体研究nm23/NDPK在肺癌中的表达结果一致。提示nm23-H₁基因在肺癌中无肿瘤抑制基因功能，可能nm23-H₁对肿瘤转移表型的调节是具有组织特异性的，在不同的肿瘤中调节作用不同。

　　综上所述，nm23-H₁蛋白表达与肺癌组织发生有关，在肺癌的形成过程中起着重要的作用；在肺癌中nm23-H₁基因没有肿瘤转移抑制作用，可能在不同的肿瘤中，nm23-H₁对转移表型的调节作用不同，有关机制需进一步研究。

　　作者简介：张良，男，住院医师，硕士

　　参考文献：

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　　［5］　Engel M,Theisinger B,Seib T,et al.High levels of nm23-H₁ and nm23-H₂ mRNA in human squamous-cell lung carcinoma are associated with poor differentiation and advanced tumor stages ［J］.Int J Cancer，1993，55:375

　　［6］　Tukunaga Y,Urano T,Furakawa K,et al. Reduced expression of nm23-H₁ but not of nm23-H₂,is concordant with the frequency of lymph-node metasatasis of human breast cancer［J］.Int J Cancer,1993,55(3):66

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　　［10］　Higashiyama M,Doi O,Yokoochi H, et al. Immunohistochemical analysis of nm23 gene product/NDPK kinase expression in pulmonary adenocarcinoma:lack of prosnostic value［J］.Cancer,1992,66:533

收稿日期：1998-09-08