肺癌组织中p15蛋白的表达意义
第四军医大学学报1999年第20卷第10期
郝光辉 戚好文 李焕章
摘 要 目的： 分析抑癌基因表达产物p15蛋白在肺癌组织中阳性表达情况.方法： 采用人p15蛋白多克隆抗体以免疫组织化学SABC染色方法检测肺癌组织病理切片.结果： p15蛋白阳性表达于部分肺癌组织细胞核或细胞质中，93例病理切片染色后得出不同类型肺癌组织的阳性表达率：肺鳞癌52.0% (26/50)，肺腺癌60.0% (9/15)，小细胞肺癌28.6% (8/28). 分化程度高的肺鳞癌和肺腺癌组织p15蛋白阳性表达率分别高于分化程度低的两种肺癌组织(P＜0.05).结论： 抑癌基因表达产物p15蛋白阳性表达于多种类型肺癌组织，肺鳞癌与肺腺癌组织阳性表达率与其分化程度有关.
关键词：肺肿瘤 免疫组织化学 基因，抑制，肿瘤
0 引言
p15蛋白由抑癌基因p15/INK4B/MTS2编码，属INK4蛋白家族. p15蛋白作用于细胞周期蛋白依赖激酶(CDK)与细胞周期蛋白D (cyclin D)复合物，特异性抑制CDK4， CDK6激酶活性，阻止其磷酸化Rb蛋白，限制细胞由G1期向S期转换，减少细胞增殖［1］. 对白血病、脑胶质母细胞瘤及黑色素瘤等多种原发性肿瘤及细胞株研究发现p15基因变异或p15蛋白表达过程改变，提示p15基因与其表达产物在肿瘤发生发展中具有一定意义［2］. 我们运用免疫组织化学SABC染色方法对p15蛋白在肺癌组织中的表达进行研究.
1 材料和方法
1.1 材料 病理标本取自西京医院病理科所存1997-01～1998-02原发性支气管肺癌患者手术或纤维支气管内窥镜活组织检查标本，计93例，均经100 mL/L福尔马林液固定及石蜡包埋，常规制备5 μm厚组织切片，经HE染色由病理科医师诊断. 根据1981年世界卫生组织肺癌分类标准进行组织学分类：非小细胞肺癌65例，其中肺鳞癌50例，肺腺癌15例；小细胞肺癌28例. 山羊抗人p15多克隆抗体(SC-b13-G)购自美国Santa Cruz公司，免疫组织化学SABC染色试剂盒购自武汉市博士德生物工程有限公司，DAB显色试剂为美国Sigma公司产品.
1.2 方法 免疫组织化学染色. 切片经二甲苯及梯度酒精脱蜡至水. 30 mL/L甲醇-过氧化氢溶液室温15 min阻断内源性过氧化物酶活性. 加热至96℃～99℃修复抗原30 min，正常兔血清封闭. 第一抗体1∶100山羊抗人p15多克隆抗体(SC-b13-G) 4℃过夜，0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS, pH 7.4) 浸洗. 1∶100生物素化兔抗山羊血清室温30 min，PBS浸洗. 链霉亲合素-生物素-过氧化物酶复合物(SABC) 37℃孵育30 min， PBS浸洗. DAB-H2O2显色4 min～8 min，苏木精轻度复染5 s，脱水透明后以中性树胶封片. 同时染色已知p15蛋白阳性切片作阳性对照，以正常山羊血清作替代对照，以0.01 mol/L的PBS (pH 7.4) 代替山羊抗人p15抗体作阴性对照，以正常兔血清代替生物素化兔抗山羊血清作阴性对照. 普通光学显微镜检测染色切片，阳性染色者细胞核或细胞质存在棕黄色颗粒. 每例切片选取5个高倍视野 (×400) 分别计算染色阳性细胞数目，平均每视野阳性细胞百分率大于5%者为阳性表达 (＋)，小于或等于5%者为阴性表达(-).
统计学方法： 采用四格表资料及2×K表资料的χ2检验方法进行统计分析.
2 结果
2.1 肺癌组织类型与p15蛋白表达 p15蛋白阳性染色切片中部分肺癌细胞的胞核或胞质内可见棕黄色颗粒(Fig 1). 各组织学类型肺癌p15蛋白阳性表达率：非小细胞肺癌53.8% (35/65)，其中肺腺癌60.0% (9/15)，肺鳞癌52.0% (26/50)；小细胞肺癌28.6% (8/28). 非小细胞肺癌与小细胞肺癌p15蛋白阳性表达率差异具有统计学意义(χ2=4.0637, P＜0.05). 肺腺癌与肺鳞癌p15蛋白阳性表达率差别无统计学意义(χ2=0.0624).
图1 肺癌组织中p15蛋白免疫组织化学阳性染色结果
Fig 1 p15 positive immunostaining in lung cancer tissue
(A) Squamous cell carcinoma SABC ×400； (B) Adenocarcinoma SABC ×400； (C) Small cell lung cancer SABC ×400
2.2 肺癌组织分化程度与p15蛋白表达 不同分化程度肺鳞癌和肺腺癌组织p15蛋白免疫组织化学染色阳性表达结果见Tab 1. 分别比较分化程度不同的肺鳞癌及肺腺癌组织p15蛋白阳性表达率，其差异具有显著性(P＜0.05). 两种肺癌组织中肿瘤组织分化程度愈高，p15蛋白阳性表达率愈高.
表1 肺鳞癌和肺腺癌组织分化程度与p15蛋白阳性表达
Tab 1 Expression of p15 in lung squamous cell carcinoma and lung adenocarcinoma
| Types |
Differentiation |
n |
Positivea |
| n |
rate/% |
| Squamous |
Well |
10 |
7 |
70.0 |
| cell carcinoma |
Intermediate |
29 |
17 |
58.6 |
| |
Poor |
11 |
2 |
18.2 |
| Adenocarcinoma |
Well |
3 |
3 |
100.0 |
| |
Intermediate |
9 |
3 |
33.3 |
| |
Poor |
3 |
0 |
0.0 |
aP＜0.05.3 讨论
p15为一种抑癌基因，定位于人9号染色体9p21［3］. p15蛋白作为cyclin D/CDK复合物的特异性抑制物参与细胞生长的调节. 近年通过原位分子杂交及PCR等方法研究发现白血病、头颈部肿瘤和非何杰金淋巴瘤等多种肿瘤细胞p15基因变异，提示p15基因及其表达产物特异性限制某些肿瘤发生及发展［4,5］. 抑癌基因p15在限制肺癌发生发展中亦具有一定作用. Okamoto等［3］对肺癌细胞株p15基因研究发现部分非小细胞肺癌 (NSCLC) 细胞株中p15基因出现纯合子缺失，推测p15基因作为NSCLC形成进展中一个重要的靶物质. p15基因的改变包括过度甲基化及纯合子缺失两种，而基因变异并非重要原因，过度甲基化p15基因于急性髓性淋巴细胞白血病及恶性神经胶质母细胞瘤患者原发性肿瘤及培养细胞株中发现［5］. Gombart等［6］认为p15与p16两种抑癌基因纯合子联合缺失更易于肿瘤的发生发展. p15与p16均位于9p21，相距3.0 kb，二者基因结构、生物化学性质具有一定的相似性，CDK4与CDK6都可与其结合，二者联合缺失可导致CDK监控缺失，细胞周期进展紊乱，可能导致肿瘤发生. Mead等［7］运用微卫星引物PCR-LOH方法发现NSCLC患者肿瘤细胞9p21中p16与p15区域容易出现杂合性缺失 (LOH)，从而认为该区域的部分基因与肿瘤发生发展有关. Kim等［8］以同样方法对小细胞肺癌(SCLC)患者手术标本研究发现肿瘤细胞9p21中p15及p16部位容易出现杂合性缺失. 两种结果均表明肺癌组织中抑癌基因p15和p16不能正常表达与肿瘤形成有关.
免疫组织化学方法可以作为检测抑癌基因失活的一种手段，Gazzeri等［9］认为肿瘤组织的免疫组织化学阴性染色与某些基因表达异常如甲基化、同源性缺失以及其它基因失活情况有关. 本实验通过免疫组织化学SABC染色方法分析肺癌组织病理切片，发现部分肿瘤细胞的细胞质或细胞核内均可表达p15蛋白. 细胞核表达表明p15蛋白作为核内蛋白可以参与肿瘤细胞核内基因调控过程，而细胞质表达则提示p15蛋白在细胞质核蛋白体合成. 研究表明分化程度较高的肺鳞癌或肺腺癌p15蛋白表达率分别高于分化程度较低的两种肺癌组织，肺鳞癌或肺腺癌组织恶性程度越高则p15蛋白阳性表达率越低，亦即其阴性表达率越高，这一结果支持p15蛋白参与限制肺癌发生发展过程的观点. p15蛋白阳性表达于SCLC与NSCLC细胞均可出现，但SCLC组织其阳性表达率相对较低，提示p15基因在该组织表达程度较低，推测可能与其失活程度较高有关. 运用免疫组织化学染色方法可以分析p15蛋白在肺癌组织中阳性表达情况，p15蛋白阳性表达率的不同有助于了解肺癌的组织类型和肿瘤组织的分化程度，结合临床资料可以初步评价肺癌患者的预后情况. 然而p15基因及其表达产物参与肺癌的发生发展过程的具体作用机制有待于进一步研究.
作者简介：郝光辉，男，1966-09-15生，辽宁省锦州市人，汉族. 1991年第二军医大学军医系毕业. 硕士生，导师戚好文. 电话：(029)3375237
作者单位：第四军医大学西京医院呼吸内科，陕西 西安 710033
参考文献
1 Takeuchi S, Bartram CR, Seriu T et al. Analysis of a family of cyclin-dependent kinase inhibitors: p15/MTS2/INK4B, p16/MTS/INK4A, and p18 genes in acute lymphoblastic leukemia of childhood. Blood, 1995; 86(2): 755-760
2 Kamb A, Gruis NA, Weaver-Feldhaus J et al. A cell cycle regulator potentially involved in the genesis of many tumor types. Science, 1994; 264(5157): 436-440
3 Okamoto A, Hussain SP, Hagiwara K et al. Mutations in the p16/INK4A/MTS1/CDKN2, p15/INK4B/MTS2 and p18 genes in primary and metastatic lung cancer. Cancer Res, 1995; 55(7): 1448-1451
4 Herman JG, Jen J, Merlo A et al. Hypermethylation-associated inactivation indicates a tumor suppressor role for p15/INK4B. Cancer Res, 1996; 56(4): 722-727
5 Gonzalez MV, Pello MF, Lopez-Larrea C et al. Deletion and methylation of the tumour suppressor gene p16/CDKN2 in primary head and neck squamous cell carcinoma. J Clin Pathol, 1997; 50(6): 509-512
6 Gombart AF, Morosetti R, Miller CW et al. Deletions of the cyclin-dependent kinase inhibitor genes p16INK4A and p15INK4B in non-Hodgkin's lymphomas. Blood, 1995; 86(4): 1534-1539
7 Mead LJ, Gillespie MT, Hung JY et al. Frequent loss of heterozygosity in early non-small cell lung cancers at chromosome 9p21 proximal to the CDKN2a gene. Int J Cancer, 1997; 71(2): 213-217
8 Kim SK, Ro JY, Kemp BL et al. Identification of three distinct tumor suppressor loci on the short arm of chromosome 9 in small cell lung cancer. Cancer Res, 1997; 57(3): 400-403
9 Gazzeri S, Gouyer V, Vour'ch C et al. Mechanisms of p16/INK4A inactivation in non-small-cell lung cancers. Oncogene, 1998; 16(4): 497-504
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