可疑肺癌病人纤支镜检查标本的p53基因突变检测
癌症 2000年第3期第19卷 基础研究
作者：郭雪君 倪培华 李莉 黄绍光 万欢英 邓伟吾
单位：郭雪君（上海第二医科大学附属瑞金医院呼吸科，上海200025）；倪培华（上海第二医科大学临床检验系，上海200025）；李莉（上海第二医科大学临床检验系，上海200025）；黄绍光（上海第二医科大学附属瑞金医院呼吸科，上海200025）；万欢英（上海第二医科大学附属瑞金医院呼吸科，上海200025）；邓伟吾（上海第二医科大学附属瑞金医院呼吸科，上海200025）
关键词：肺癌；纤维支气管镜；p53基因；突变检测
摘 要：目的：探讨纤支镜检查标本的p53基因突变检测用于肺癌早期诊断的可行性。方法：采用聚合酶链反应－单链构象多态性分析（PCR－SSCP）银染技术，对35例怀疑为肺癌病人的85份纤支镜检查标本行p53基因5～8号外显子突变检测。结果：发现10例病人有p53基因突变(28.6％)，其中以6号外显子突变率最高（17.1％）。在85份标本中，纤支镜后痰、灌洗和刷检标本的p53突变率明显高于相应标本的细胞学阳性率(t=2.4160,P＜0.05)。其中以痰的p53突变率最高（27.6％)(t=2.0200,P＜0.05)，但活检组织的p53突变率明显低于病理学阳性结果（t=2.3300,P＜0.05）,而综合分析所有痰、灌洗、刷检和活检标本的细胞学和病理学阳性率则与p53突变率之间无明显差异。虽然纤支镜表现为支气管内新生物时所获标本，其p53突变率（45.5％）高于表现为支气管狭窄和/或管口间嵴增宽,粘膜炎症(分别均为25.0％),但统计学上无差异。值得注意的是，3例有p53突变的病人纤支镜仅表现为粘膜炎症。结论：纤支镜检查标本的p53基因突变检测对肺癌的诊断价值优于相应标本的肿瘤细胞学检查。单独取用痰标本，即可较理想地进行p53突变检测，可作为肺癌早期诊断有价值的方法之一。
分类号：R734.2 文献标识号：A
文章编号：1000－467(2000)03－0216－03
Detection of p53 gene mutation of bronchoscopic samples
in the patients suspected to lung cancer
GUO Xue－jun NI Pei－hua LI Li et al.
（Depatment of Respiratory Medicine,Ruijin Hospital,Shanghai Second
medical University, Shanghai 200025,P.R.China）
Abstract：Objective： To ascertain the feasibility of detecting p53 gene mutations for early diagnosis of lung cancer using the samples from fibroptic bronchoscopic examination. Methods： Piont mutations of the exon 5～ 8 of p53 gene were analysed using silver staining PCR－SSCP in 85 bronchoscopic samples of 35 patients suspected to be lung cancer Results： The p53 gene mutations were founded in 10 of 35 patients (28.6％ ). The incidence of p53 gene mutations (14.9％ ) in samples of sputum, bronchial lavage and brush, especially in the sputum(27.7％ ) was obviously higher than the cytological positive incidence (2.9％ ) . In the bronchoscopic biopsy specimens, the incidence of p53 gene mutations(12.5％ ) was lower than that of pathologic positive result(50.0％ ). However, in view of all the bronchoscopic samples, there was no statistically difference between cytopathologic positive results(11.8％ ) and the incidence of p53 gene mutations(14.1％ ). Although the incidence of p53 mutations was higher in the samples from the patients bronchoscopically manifested as neoplasm compared with other manifestations, the difference was stafistically not significant. It is valuable to notice that 3 patients with p53 gene mutation merely presented as bronchial inflamation in bronchoscopy. Conclutions： The present results indicate that the value of detecting p53 gene mutation using the bronchoscopic samples for the diagnosis of lung cancer was more superior to cytologic examination.The detection of p53 gene mutations in postbronchoscopic sputum was easy and effective, may be used as a valuable method for early diagnosis of lung cancer.
Key words：Lung cancer; Bronchoscopy; p53 gene; Mutation detection▲
肺癌同其它恶性肿瘤一样，是由于遗传物质改变引起的基因病。P53基因突变是肺癌最常见同时亦是较为早期的遗传改变。以往有关肺癌p53基因分子改变的报道，主要为肺癌手术切除组织，对临床上肺癌诊断价值不大。本文对临床高度怀疑为肺癌的病人行纤维支气管镜检查，采用多聚酶链－单链构象多态性分析（PCR-Single strand conformation polymorphism,PCR-SSCP）技术，对纤支镜后痰以及纤支镜活检、刷检、支气管灌洗液标本分别进行p53基因5～8号外显子的突变检测。
1 材料和方法
1.1 标本来源
临床高度怀疑为肺癌病人35例。男29例，女6例。年龄57.7±11.1岁。临床症状包括：刺激性咳嗽、痰血、胸痛。X线表现包括：（1）肺段或叶不张；（2）肺外周结节影；（3）肺门块影；（4）阻塞性炎症改变。35例病人均有上述表现中的一种。纤支镜检查表现包括：（1）支气管见新生物；（2）支气管管口狭窄和/或管口间嵴增宽;(3)支气管粘膜充血水肿等炎症表现;(4)无明显异常。病人根据纤支镜表现不同分别行活检、刷检、支气管灌洗以及纤支镜检查后取痰标本。所有病人取外周血3ml。
1.2 DNA抽提
痰标本加等容积1mol/LNaOH消化,1000rpm离心10min,弃上清,沉淀物用PBS、ddH2O各2ml分别洗涤后离心10min，沉淀物加裂解液1ml（10mmol/LTris.Hcl,pH8.2,400mmol/LNaCl,2mmol/LEDTA,10％SDS,2mg/ml蛋白酶K）37℃孵育过夜。刷检和灌洗标本离心后加裂解液。活检标本直接加裂解液，37℃孵育过夜，酚/氯仿抽提，无水乙醇沉淀。DNA用TE溶解。外周血用常规方法抽提。
1.3 PCRSSCP
用于p53基因5～8号外显子PCR扩增的引物(见表1)。
表1 PCR扩增引物
| 外显子 |
引物序列 |
片断大小 |
| Exon5 |
P15－TACTCCCCTGCCCTCAACAA－3 |
184bp |
| P25－CATCGCTATCTGAGCAGCGC－3 |
| Exon6 |
P15－GTCTGGCCCCTCCTCAGCAT－3 |
132bp |
| P25－CTCAGGCGGCTCATAGGGCG－3 |
| Exon7 |
P15－TCTGACTGTACCACCATCCA－3 |
110bp |
| P25－CTGGAGTCTTCCAGTGTGAT－3 |
| Exon8 |
P15－TGGTAATCTACTGGGACGGA－3 |
88bp |
| P25－CGGAGATTCTCTTTCTTCTGT－3 |
PCR扩增体系为50μl,含基因组DNA100ng,200mmol/LdNTP,1.5mmol/LMgCl2,0.25μmol/L引物,1uTaq酶。反应条件为：95℃预变性5分钟；95℃40秒；60℃40秒；72℃70秒。35周循环。5μlPCR产物95℃变性10秒，冰浴骤冷后上样于12％聚丙稀酰胺凝胶，室温下2W电泳2～3小时。取下凝胶银染：固定液（10％乙醇，5％冰乙酸）固定10分钟；染色液（0.2％AgNO3）染色5分钟;显色液(1.5％NaOH,0.4％甲醛)显色直至出现条带。以每例病人外周血相应扩增产物聚丙稀酰胺凝胶电泳后出现的条带作为正常对照，如纤支镜标本电泳出现条带迁移率变化或出现异常条带，则视为p53基因相应外显子突变。统计采用小样本百分率t检验。
表2 10例p53基因突变的可疑肺癌病人资料
| 编号 |
纤支镜表现 |
病理 |
脱落
细胞 |
p53基因突变 |
| 纤支镜活检 |
手术组织 |
痰 |
活检 |
灌洗 |
刷检 |
| 1 |
左舌叶新生物 |
低分化癌 |
肺泡细胞癌 |
鳞癌 |
E7 |
－ |
－ |
－ |
| 2 |
左上叶新生物 |
－ |
鳞癌 |
－ |
E8 |
E8 |
E6,E8 |
－ |
| 3 |
炎症表现 |
可疑癌细胞 |
N |
腺癌 |
E6 |
－ |
－ |
－ |
| 4 |
管口狭窄 |
鳞癌 |
N |
－ |
E6 |
－ |
－ |
－ |
| 5 |
炎症表现 |
－ |
肺泡细胞癌 |
－ |
E6 |
－ |
－ |
－ |
| 6 |
左上叶新生物 |
鳞癌 |
N |
－ |
E6 |
－ |
－ |
－ |
| 7 |
左上叶新生物 |
－ |
鳞癌 |
－ |
E6 |
－ |
－ |
－ |
| 8 |
管口狭窄 |
－ |
腺癌 |
－ |
－ |
E5,E8 |
－ |
－ |
| 9 |
左中叶新生物 |
－ |
鳞癌 |
－ |
E5 |
－ |
－ |
－ |
| 10 |
炎症表现 |
－ |
腺癌 |
－ |
－ |
－ |
－ |
E7 |
2 结果 35例可疑肺癌病人的纤支镜标本共85份纤支镜标本的细胞学、病理学和p53基因突变检测结果见表3。35例可疑肺癌病人的纤支镜表现与细胞学/病理学和p53突变检测的结果见表4。
表3 85份纤支镜检查相关标本细胞学/病理学及p53基因突变检测结果
| 项目 |
痰(n29) |
灌洗(n22) |
刷检(n18) |
活检(n16) |
合计(n85) |
| 细胞学/病理学阳性 |
2(6.9％) |
0 |
0 |
8(50.0％) |
10(11.8％) |
| p53基因突变 |
8(27.6％) |
1(4.5％) |
1(4.5％) |
2(12.5％) |
12(14.1％) |
| P值 |
＜0.05 |
＞0.05 |
＞0.05 |
＜0.05 |
＞0.05 |
表4 纤支镜表现与细胞学/病理学及p53基因突变检测结果
| 纤支镜表现 |
n |
细胞学/病理学阳性 |
p53基因突变 |
P |
| 新生物 |
11 |
3(27.3％) |
5(45.5％) |
＞0.05 |
| 管口狭窄/嵴增宽 |
12 |
4(33.3％) |
3(25.0％) |
＞0.05 |
| 炎症表现 |
3 |
3(37.5％) |
2(25.0％) |
＞0.05 |
| 无异常表现 |
4 |
0 |
0 |
|
3 讨论 p53基因位于17p13.1。p53基因结构和表达异常是迄今为止肺癌中最常见的分子改变。尽管在肺癌中p53基因突变不是使正常细胞转化为恶性细胞的最初和最关键的事件，但许多研究已证实p53基因突变在肺癌是早期事件[1]。PCR-SSCP是目前最常用的检测肿瘤基因突变的筛查方法。近年,人们已开始关注临床非手术检查标本的p53基因突变检测在肺癌早期诊断中的应用[2]。Sundaresom等[3]研究了肺癌17p杂合性丢失和p53蛋白过度表达，但其研究仅为2例标本。Hrano和Walker等[4～6]研究了肺癌病人支气管上皮化生和不典型增生，他们采用的方法是免疫组化而非基因分子改变的直接检测。Mistudomi等[7]使用荧光纤支镜系统获取支气管活检标本，采用PCR-SSCP技术检测4例肺癌病人支气管活检组织p53基因发生突变。Mao等[8]采用PCR依赖的技术检测了冻存痰标本，发现8例病人在临床确诊肺癌前13～24个月，细胞学检查阴性的冻存痰中已有p53、ras基因的突变，但该项研究采用复杂的细胞培养和克隆技术，难以应用于临床。
我们在35例高度怀疑为肺癌病人的纤支镜检查标本中发现10例病人有p53基因突变，突变率为28.6％,其中5例纤支镜表现为支气管内可见新生物(50.0％),2例为支气管管口狭窄和/或管口间嵴增宽(20.0％)。值得注意的是有3例仅表现为支气管粘膜炎症（30.0％）。p53基因5～8号外显子突变率分别为5.7％；17.1％；5.7％；5.7％，以6号外显子突变率最高，这与我们对肿瘤切除组织p53基因突变检测的结果一致（资料未列出）。2例病人有2个外显子同时发生突变，1例病人的纤支镜后痰和活检、灌洗液标本均发现有p53基因突变。
在85份纤支镜检查标本中，痰标本的p53突变率显著大于相应细胞学检查阳性率(t=2.0200,P＜0.05）。虽然灌洗、刷检标本的p53基因突变率大于细胞学阳性率，但统计学了无明显差异（t分别为0.6108；0.6579，p均大于0.05）．综合所有纤支镜后痰、灌洗、刷检标本的p53突变率，亦明显高于细胞学检查阳性率（t=2.416，p＜0.05）．在活检标本中，病理学阳性率则大于p53突变率（t=2.3300，p＜0.05）．但综合分析所有痰、灌洗、刷检和活检标本的细胞学和病理学阳性率与p53突变率之间则无明显差异（t=0.4570，p＜0.05）．
上述结果表明与纤支镜检查相关标本的p53突变检测优于相应标本的肿瘤细胞学检查，尤其是纤支镜后痰的p53基因突变率高于活检、刷检和灌洗液，且痰标本易于留取，处理简单，提示在临床上单独取用痰标本即可有效地进行可疑肺癌病人的p53基因突变检测。活检组织p53基因突变率低于病理检查阳性率，可能是由于（1）仅取一块组织进行p53突变检测，且此块组织的活检部位与用于病理检查的组织活检部位在操作中有所偏差（主要由于活检后出血影响视野）；（2）活检组织的DNA抽提方法不理想（可能为组织消化不理想）。故这两方面有待完善。
尽管纤支镜表现为支气管内新生物时所获标本，其p53突变率高于纤支镜表现为支气管管口狭窄和/或嵴增宽，以及炎症表现时所获标本的p53突变率，但在统计学上无差异。表明来源于不同纤支镜表现的标本，对p53突变检测的结果并无影响。
基金项目：本课题受卫生部科研基金(编号：94－1－316)资助
通讯作者：郭雪君：Tel：86－21－64314162 E－mail：guoxjz@public4.sta.net.cn
参考文献：
［1］郭雪君,邓伟吾,黄绍光.肺癌癌基因和抑癌基因的研究进展[J].中华结核和呼吸杂志,1995,18：267～269.
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［4］Hirano T, Franzen B, Kato H, et al. Genesis of squamous cell lung carcinoma Sequential changes of proliferation,DNA ploidy, and p53 expression[J]. Am J Pathol,1994,144： 298～ 302.
［5］Walker C, Robertson LJ, Myskow MW, et al. p53 expression in normal and dysplastic bronchial epithelium and in lung carcinomas [J]. Br J Cancer,1994,70：297～ 303.
［6］Dowell SP, Wilson PO, Derias NW, et al. Clinical utility of the immunocytochemical detection of p53 protein in cytological specimens [J]. Cancer res,1994,54： 2914～ 2918.
［7］Mitsudomi T, Lam S, Shirakusa T, et al. Detection and sequencing of the p53 gene mutations in bronchial biopsy samples in patients with lung cancer [J]. chest,1993,104： 362～ 365.
［8］Mao L, Hruban RH, Boyle JO, et al. Detection of oncogene mutations in sputum precedes diagnosis of lung cancer [J]. Cancer Res,1994,54： 1634～1637.
收稿日期：1999－07－22
修稿日期：1999－10－28
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