AnnexinI在α粒子转化细胞及肺癌组织中高表达
癌症 2000年第6期第19卷 快速报道
作者：彭少华 吴德昌 李刚 项晓琼 楼铁柱 赵永良
单位：彭少华 吴德昌 李刚 项晓琼 楼铁柱 赵永良（军事医学科学院放射医学研究所分子毒理研究室，北京100850）
关键词：AnnexinI；肺肿瘤；BEP2D细胞
【摘要】目的：探讨AnnexinI表达与肺癌及细胞转化的关系。方法：Western印迹、Northern印迹检测永生化人支气管上皮BEP2D细胞及α粒子照射转化后BEP2D细胞中AnnexinI在mRNA和蛋白质水平的表达，细胞免疫化学检测AnnexinI在BEP2D细胞中的分布。Western印迹检测肺癌病人正常组织与肿瘤组织中AnnexinI蛋白质的表达。结果：AnnexinI在α粒子照射转化后BEP2D细胞中mRNA和蛋白质水平上的表达光密度均为永生化人支气管上皮BEP2D细胞的1.5倍；AnnexinI在BEP2D细胞中分布于胞浆及细胞膜。本研究收集了8例肺鳞癌、4例肺腺癌病人的肺肿瘤组织及正常组织，AnnexinI在肺癌组织中的表达明显高于正常组织（P＜0.01），AnnexinI在肿瘤组织中表达的光密度与正常肺组织之比为2.7。结论：AnnexinI在肺癌组织过表达，表明AnnexinI可能与肺癌及细胞恶性转化的发生发展有关。永生化及α粒子照射恶转BEP2D细胞为进一步研究AnnexinI在恶性转化中的作用提供了良好的模型。
中图分类号：R734.2;R730.231 文献标识码：A
文章编号：1000－467X(2000)06－0507－05
Overexpression of Annexin I in transformed BEP2D cells by
α－ particles and lung cancer tissues
PENG Shao－hua， WU De－chang， LI Gang， et al.
Department of Molecular Toxicology, Beijing Institute of Radiation Medicine, Beijing 100850, P.R.China
【 Abstract】 Objective: To evaluate the expression of Annexin I, a calcium-dependent phospholipid binding protein, in relation to lung cancer development and progression, and malignant transformed human bronchial epithiliar cells (BEP2D) by α －particle. Methods: In this study the expression level of Annexin I had been determined by Western blot and Northern blot. The distribution of Annexin I in BEP2D cells was studied by cellular immunochemistry. Results: Northern blot and Western blot showed that the expression level of Annexin I was moderate in immortalized BEP2D cells, but was overexpressed in α－particles transformed BEP2D cells. The amount of expression in transformed BEP2D cells is 1.5 times as high as in the immortalized ones both in mRNA and protein levels. In BEP2D cell Annexin I distributes on membrane and in plasma, but not in nucleus. However, no difference of distribution between immortalized BEP2D cells and α－particle transformed BEP2D cells was observed. Furthermore, the expression of Annexin I in nontumorous and tumorous lung tissues was determined, which were collected from 4 lung adenocarcinoma and 8 squamous cell carcinoma patients. Western blotting showed that more Annexin I was expressed in the lung tumorous tissues than in the lung nontumorous tissues, which derived from the same case. The optical density analysis showed that the ratio of expression in the tumorous tissues compared with the nontumorous tissues is 2.7 (P＜0.01). Conclusions: The expression level of Annexin I is upregulated after cell malignant transformation, and the expression of Annexin I is related to lung cancer. These results suggest that Annexin I overexpression could be a factor implicated in lung tumorigenesis. The model of α particles transformed BEP2D cell line and immortalized BEP2D cell line would offer a novel tool with which to study the function of Annexin I in malignant transformation.＜ 0.01). Conclusions: The expression level of Annexin I is upregulated after cell malignant transformation, and the expression of Annexin I is related to lung cancer. These results suggest that Annexin I overexpression could be a factor implicated in lung tumorigenesis. The model of α particles transformed BEP2D cell line and immortalized BEP2D cell line would offer a novel tool with which to study the function of Annexin I in malignant transformation.
Key words: Annexin I; Lung neoplasms; BEP2D cell
我们早期的研究表明AnnexinI基因是α粒子诱发大鼠气管上皮细胞恶性转化高丰度表达的基因之一[1]，提示AnnexinI表达可能与细胞恶转有关。AnnexinI是一种具有多种功能的蛋白。近年来发现其表达与某些肿瘤的发生发展有关，但与肺癌的关系尚未见文献报道。本研究观察了人永生化支气管上皮细胞（BEP2D）受1.5Gy剂量的α粒子照射恶性转化后AnnexinI基因的表达变化，并首次观察了该基因在肺癌病人中的表达改变。
1 材料与方法
1.1 细胞培养
永生化BEP2D细胞系由美国NIH的HarrisCC教授提供[2]，1.5Gyα粒子照射后连续培养，第35代恶转BEP2D细胞（已在裸鼠成瘤）由本实验室建立。永生化及恶转BEP2D细胞用HLC-8无血清培养基（美国，BiofluidsInc.）37℃于CO2培养箱中培养。
1.2 组织来源
来源于同一病人的正常肺组织和肿瘤组织，取材后立即冻存于液氮中，－70℃保存。临床病理诊断：8例为肺鳞癌，其中1例为高分化鳞癌，4例为中分化鳞癌，2例为低中分化鳞癌，1例为低分化鳞癌；4例为肺腺癌，其中1例为中分化腺癌，其余3例为低分化腺癌。
1.3 Westernblot
1.3.1细胞蛋白提取：细胞常规培养达指数生长期时胰酶消化，接种2×106个细胞于100mm培养皿培养24小时，标准方法提取[3]，100℃煮沸变性4分钟，蛋白等量上样。
1.3.2肺组织蛋白提取：根据Masaki[4]等的方法进行AnnexinI蛋白的纯化，并作部分修改。所有过程均在4℃中进行。称取0.5～1g肺组织，PBS洗净，于匀浆缓冲液中匀浆（10mmol/L的二硫苏糖醇，100μg/ml的大豆胰蛋白酶抑制剂，1μg/ml的亮抑肽和10mmol/L的氯化钙）。静置20分钟，2900g离心15分钟，将上清转移至另一离心管中，27000g离心40分钟。沉淀重悬于BufferA中（100mmol/L氯化钠,1mmol/L二硫苏糖醇,1mmol/L氯化钙,1％TritonX-100和10mmol/L盐酸咪唑,pH7.4），震荡20分钟，25000g离心30分钟。沉淀用不含TritonX-100的BufferA洗涤两次，重悬于BufferB中（100mmol/L氯化钠,1mmol/L二硫苏糖醇,1mmol/LEGTA和10mmol/L盐酸咪唑，pH7.4），30000g离心45分钟。上清用Bradford[5]方法定量，30μg蛋白等量上样。
1.3.3Westernblot：所有电泳装置均为北京六一仪器厂产品。N-19人AnnexinI多克隆抗体，辣根过氧化酶标记山羊抗人AnnexinI抗体，增强化学发光检测试剂盒（enhancedchemoluminescence,ECL）均购自美国SantaCruzBiotechnology公司，低分子量标准蛋白质（14.40～97.40KDa）购自上海丽珠东风生物技术有限公司。15％SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝R-250凝胶染色，或100mA过夜将蛋白转移至NC膜（Hybond），Blotto封闭30分钟，分别与一抗、二抗杂交，ECL试剂与膜反应，放射自显影于X光胶片上。
1.4 Northern印迹分析
细胞总RNA提取按GIBCO公司Trzol试剂盒说明书进行。取20μg总RNA甲醛变性胶电泳，真空转印至尼龙膜(Amersham)。Prime-a-Gene随机引物法合成探针(Promega)。标准方法杂交[3]。
1.5 免疫细胞化学分析
细胞常规培养达指数生长期时胰酶消化，接种5×105个细胞与预先放置盖玻片的60mm培养皿中，继续培养48小时，PBS冲洗2次，冷95％乙醇固定30分钟，DAB法染色，常规脱水，中性树脂封片。同时分别以PBS和正常山羊血清代替一抗作空白对照和替代对照。AnnexinI基因表达为细胞膜和细胞浆黄褐色染色。
1.6印迹密度及统计分析
采用基因公司的凝胶成像系统和美国UVP公司的LabWorkTM分析软件，对Westernblot和Northernblot印迹的光密度扫描分析表达量。t检验分析肺组织中AnnexinI蛋白表达差异显著性。
2 结果
2.1 AnnexinI在BEP2D细胞中的表达与分布
2.1.1Northern印迹分析AnnexinImRNA的表达：图1显示永生化BEP2D细胞和α粒子照射后35代转化BEP2D细胞中均有AnnexinImRNA的表达，光密度分析表明，AnnexinImRNA在恶性转化后细胞中的表达量为永生化的1.5倍。
2.1.2Western印迹分析AnnexinI蛋白质的表达：AnnexinI在永生化和α粒子照射后35代转化BEP2D细胞中均有蛋白质的表达，但转化后的细胞中AnnexinI的蛋白质表达明显高于永生化细胞，光密度分析表明两者之比为1.5（图2）。
2.1.3AnnexinI在BEP2D细胞中的分布：细胞免疫化学表明，AnnexinI在BEP2D细胞中主要分布于胞浆和胞膜上，细胞核中无AnnexinI免疫反应活性（图3）。永生化和恶转BEP2D细胞未见明显差别。
图1 AnnexinI的Northern杂交结果(箭头：14Kb)
1:永生化BEP2D细胞;2:α粒子照射后第35代BEP2D细胞
图2 AnnexinI的Western杂交结果
1:永生化BEP2D细胞;2:α粒子照射后第35代BEP2D细胞
图3 AnnexinI在细胞中主要分布于细胞浆和细胞膜
a:永生化BEP2D细胞;b:α粒子照射后第35代BEP2D细胞
2.2 AnnexinI蛋白在肺正常组织与肺肿瘤组织中的表达
AnnexinI在12例肺癌组织中的表达均明显高于来自同一病人的正常肺组织（图4）。其中1～8为肺鳞癌病人的肺组织，9～12为肺腺癌病人的肺组织，肺癌组织中存在分子量为35KDa（2～4、6、7、9、11）、38KDa（1～12）、40KDa（1、4、5、11）、42KDa（4、5）、44KDa（5、8）48KDa（8）的AnnexinI免疫反应带；正常组织中存在35KDa（3、4、7、9、11）、38KDa的带（1、3～7、9～12）、40KDa（1、4、5）、42KDa（4、5）的免疫反应带，第2和8例中未见表达。
对Western印迹获得的38KDa免疫反应带的光密度进行分析，AnnexinI在8例肺鳞癌组织中表达的光密度与正常肺组织之比为2.9，在4例肺腺癌组织中表达的光密度与正常肺组织之比为2.25，平均为2.7。统计分析表明AnnexinI在肿瘤组织中的表达显著高于正常组织（P＜0.01）（图5）。
3 讨论
Annexins是一类钙依赖的、磷脂结合蛋白家族，目前至少发现了13个成员。AnnexinI是最早被发现并研究得最为深入的蛋白之一。AnnexinI为表皮生长因子受体（EGFR）激酶、蛋白激酶C等的磷酸化底物，具有多种生物学功能，例如调节磷脂酶A2的活性，炎症、胞吐、分化、增殖、血凝、免疫应答、膜细胞骨架连接和细胞内信号传导等。但目前对于其确切的作用机制仍不十分清楚。
正常情况下AnnexinI具有组织特异性分布，并且具有特征性表达类型[6]。例如AnnexinI在外周血白细胞、组织巨噬细胞及一些上皮细胞（呼吸道、尿道和非角质化的磷状上皮）中有较高丰度的表达；而在人肝组织中的表达量几乎难以检测，胰岛外分泌腺体的泡心和管状细胞中无表达。在不同类型的细胞中AnnexinI免疫活性分布也不完全一致，例如，AnnexinI除了分布于细胞膜和细胞浆中，也存在于某些类型细胞的胞核中。这些特征性的组织表达及细胞内分布表明该蛋白与这些组织特有的分化和/或生理功能有关。而在炎症、癌变等病理情况下，原来检测不到或有一定程度表达的部位出现表达或过表达[4,7]。免疫组化发现AnnexinI在永生化BEP2D细胞中主要分布于胞浆和胞膜上，而细胞核中无AnnexinI免疫反应活性（图3），与文献报道一致[6]，同时也间接说明了永生化BEP2D细胞来源于正常人支气管上皮细胞。永生化和恶转BEP2D细胞在免疫组化中未见明显差别，可能是由于AnnexinI在永生化细胞中已有中等程度的表达，制片过程中的误差或方法本身的灵敏度难以区分其表达差异。Northern和Western印迹检测也发现在永生化BEP2D细胞中有中等程度的表达，但α粒子照射恶转后的细胞中AnnexinI的表达在转录和翻译水平均高于永生化细胞（图1，2），表明AnnexinI可能为BEP2D细胞恶性转化中的因素之一。
图4 AnnexinI的Western杂交结果
图5 12例肺癌病人正常肺组织与肿瘤肺组织
AnnexinI表达光密度均值比较
AnnexinI在正常肺组织与肿瘤肺组织中表达光密度之比为2.9(P＜0.01)
本研究采用的人支气管上皮细胞系BEP2D为全长人乳头瘤病毒（HPV18）转染正常人支气管上皮细胞（NHBE）构建的永生化细胞[2]，这些细胞在体外肺癌病人肺正常组织(N)与癌组织(T)30μg部分纯化的AnnexinI蛋白上样,SDS-PAGE电泳,100mA电转移至NC膜,AnnexinI抗体杂交,ECL法显迹。1～8为肺鳞癌病人的肺组织，9～12为肺腺癌病人的肺组织。肺癌组织中的AnnexinI表达高于正常组织。连续传代100次以上未发生衰老和死亡，接种裸鼠饲养12个月以上未观察到成瘤性，排除了融合诱导的鳞状分化，表明它们获得了永生化，并且在受到致癌因素如石棉纤维、α粒子等[7,8]的作用下具有产生恶性转化的趋向。本实验室利用BEP2D细胞建立了α粒子辐射恶性转化的BEP2D细胞系，从而可以对其转化过程中各个阶段的AnnexinI表达及其分子机制进行研究，为进一步研究AnnexinI在细胞恶性转化中可能的作用提供了有效的模型。
自从1996年Masaki[4]等发现肝癌组织中AnnexinI高表达以来，相继在乳腺癌组织、食管癌组织中发现有高表达[9,10]。为了进一步探讨AnnexinI表达与肺癌的关系，我们检测了8例肺鳞癌和4例肺腺癌病人肺正常组织和肿瘤组织中AnnexinI的蛋白表达水平，所有12例病人癌组织中AnnexinI的表达均明显高于正常组织。本研究发现肺组织中有多种与AnnexinI抗体起特异反应的抗原存在（图4），其中38KDa带是其主要的形式，因此在光密度分析中对该种形式的蛋白进行了比较。AnnexinI存在多种形式已有多篇文献报道。在文献报道的9例人肝癌组织和非癌肝组织中35KDa是其主要形式，此外尚存在38、42和80KDa三种形式[4]。另外还发现在嗜中性白细胞中AnnexinI蛋白的分子量为33KDa，大脑皮质中为74KDa，血小板细胞中为40KDa。同一样本中出现多种形式的同种蛋白可能是由于形成二聚体、磷酸化状态、蛋白降解等因素所造成的。但在BEP2D细胞中只存在38KDa一种形式（图2）。
近年来的文献报道表明AnnexinI表达与肿瘤的发生发展有关。deCoupade[11]等发现正常小鼠获得的原代肝细胞无AnnexinI的表达，而在转基因并随后发展成为肝癌的小鼠肝细胞中为高表达。并且在转基因小鼠的肝中，AnnexinI表达的增加在肿瘤形成之前。在人病理标本中，癌前的一些病理变化中也出现了类似的现象，推测其可能在癌变早期即参与了肿瘤形成的过程[4,9,12]。肺癌早期病变中是否也存在类似的情况，可以通过收集不同时期的标本，建立适当的研究模型探讨AnnexinI表达与肺癌早期病变的关系，这将对肺癌的早期诊断、治疗及进一步了解肺癌的发病机制具有重要的意义。
上述分析表明，AnnexinI过表达与细胞恶性转化和肺癌有关，为探讨肺癌的发病机理和诊断提供了新的线索。但由于恶性转化与肿瘤发生发展机制是一种多阶段、多基因作用的复杂过程，AnnexinI在肿瘤中高丰度表达的意义，与已知癌基因、抑癌基因的关系等尚需作进一步的深入探讨和研究。
基金项目：本课题受中国博士后基金和国家重点基础专项经费(G1998051208)资助
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收稿日期：2000－03－24;修回日期：2000－04－14
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