p16基因及产物在原发性肺癌中的表达及其临床病理学意义
中国肺癌杂志 2000年第1期第3卷 肺癌分子生物学研究
作者：张莉 李应珍
单位：张莉 李应珍(新疆医科大学第一附属医院肺科 乌鲁木齐，830054)
关键词：原发性肺肿瘤；p16基因；基因缺失
【摘要】目的 探讨p16基因及产物的异常表达与肺癌发生、发展的关系。方法 应用免疫组化检测114例原发性肺癌组织中p16蛋白的表达，应用PCR技术分析62例p16蛋白表达丢失的肺癌组织中p16外显子2(E2)的缺失情况，并以14例癌旁正常肺组织作对照。结果 p16蛋白阳性表达率在鳞癌、腺癌和小细胞肺癌中分别为43.2％、48.5％和27.0％，各组间无显著差异(P＞0.05)；p16蛋白表达水平与非小细胞肺癌(NSCLC)的组织学分级和淋巴结转移有密切关系。NSCLC中p16 E2的缺失率为45.2％，缺失水平与淋巴结转移和组织学分级密切相关(P＜0.05)。小细胞肺癌(SCLC)和癌旁正常肺组织中无p16 E2的缺失。结论 p16基因及产物的异常表达与NSCLC的组织学分级和转移相关，它可能参与NSCLC的发生、发展和转移过程。
The clinicopathologic significance of the p16 gene expression in primary lung cancer
ZHANG Li,LI Yingzhen
(Department of Pulmonary Diseases,The First Hospital,Xingjiang Medical University,Urumqi 830054,P.R.China)
【Abstract】Objective To explore the relationship between p16 gene expression and oncogenesis,and development of human lung cancer.Methods Immunohistochemistry was employed to detect the expression of p16 protein in 114 paraffin-embedded primary lung cancer tissues.Loss of p16 INK 4 gene exon 2 (E2) was analyzed using PCR technique in 62 cancer samples with p16 protein-negative stain and 14 paracancerous lung tissues.Results The positive rates of p16 protein expression in squamous cell carcinoma,adenocarcinoma and small cell lung cancer (SCLC) were 43.3％,48.2％ and 27.0％ respectively,and no significant difference was found among them (P＞0.05).The expression level of p16 protein was closely correlated with histological grade and lymph node metastasis of lung cancer.The deletion of p16 E2 was 45.2％ in NSCLC and closely related to lymph node metastasis and histological grade (P＜0.05).No deletion was observed in 37 cases of SCLC and 14 paracancerous lung tissues.Conclusion Alteration of p16 gene and protein is closely related to the histological grade and lymph node metastasis of NSCLC.It may play an important role in the oncogenesis,development and lymph node metastasis of NSCLC.
【Key Words】Primary lung neoplasms p16 gene Gene deletion
自1993年首次发现并报道了p16基因以来，人们对其结构、功能以及与肿瘤关系的研究逐步深入，并取得了一些突破性的进展［1～4］，但是免疫组化联合PCR技术同时检测p16基因及产物的异常表达及其与临床病理学联系的研究较少。我们应用以上两种技术同时检测114例原发性肺癌癌组织中p16蛋白表达和p16外显子(E2)的缺失情况，以探讨p16基因及产物与肺癌发生、发展的相关性，为临床判断预后及治疗提供分子病理学依据。
1 材料与方法
1.1 标本来源 收集我院自1990～1998年经手术切除和气管镜活检的肺癌组织石蜡包埋标本共114份，患者均为原发性肺癌，术前未作放化疗。全组鳞癌44例，其中Ⅰ级(高分化)23例，Ⅱ级(中分化)10例，Ⅲ级(低分化)11例，伴淋巴结转移20例；腺癌33例，Ⅰ级8例，Ⅱ级11例，Ⅲ级14例，伴淋巴结转移8例；小细胞肺癌37例。取14例癌旁正常肺组织作对照。
1.2 LSAB－免疫组化染色
1.2.1 主要试剂 抗p16蛋白多克隆抗体(Santa Cruz公司)；生物素标记的羊抗兔抗体(Dako公司)；SP复合物(Dako公司)。
1.2.2 LSAB法 将4?μm厚的石蜡切片常规脱蜡，逐级水化。先经0.3％H2O2阻断内源性过氧化物酶，枸橼酸缓冲液行抗原修复；然后依次加入正常小牛血清(1∶100)，一抗(1∶40)，二抗(1∶400)，三抗(1∶400)，以上各步均经微波低中火孵育5?min，PBS冲洗(除小牛血清)。最后AEC显色，苏木素复染，甘油明胶封片。选用已知阳性乳腺癌组织为阳性对照，用PBS代替一抗作阴性对照。
1.3 PCR
1.3.1 主要试剂 琼脂糖；DNA提取液；p16 E2反应液(分子量为244?bp)；Taq酶；正常模板；电泳指示剂(以上由中山医科大学达安基因诊断中心提供)；PCR Marker是Dako公司产品。
1.3.2 标本处理 将石蜡包埋的组织切成4?μm厚，3或4张装于小管中，然后用二甲苯、无水乙醇脱蜡。68℃温箱干化2 h，加入DNA提取液100?μl，于37℃温箱过夜，100℃加热10?min后离心。
1.3.3 PCR扩增 取p16 E2反应液26.5?μl，依次加入样本DNA?2?μl(或直接加2?μl正常模板做正常对照)，Taq酶1.5?μl，石蜡油20?μl，按下列条件立即扩增：94℃?3?min预变性，然后94℃?45?s55℃?45?s72℃?60?s，共行35个循环。
1.3.4 PCR扩增产物电泳 PCR产物在2％琼脂糖凝胶上电泳，以阳性模板为对照，观察结果。
1.4 p16蛋白染色结果的判定 每张切片选5个高倍视野，每个视野计数200个肿瘤细胞，按胞核或胞质染成棕红色的数目占计数细胞的百分比判定结果：＋，＜30％；，30％～75％；，＞75％；－，无胞核或胞浆染色。
1.5 数据处理 用卡方检验或确切概率法行显著性检验，P＜0.05为有统计学意义。
2 结果
2.1 阳性细胞和阳性反应带表达的特征 图1示肺腺癌p16蛋白免疫染色阳性，胞浆呈棕红色。图2示SCLC p16蛋白免疫染色，胞核着色。在紫外线检测上，p16 E2阳性反应带清晰、粗细均匀，为与正常对照处于同一位置的橙黄色条带，在Marker的150～300?bp之间(图3)。
2.2 p16蛋白表达与肺癌相关指标的关系 从表1可见正常组织p16蛋白阳性表达率明显低于肺癌组织，但各肺癌组织学类型组p16蛋白阳性表达率差别无显著性(P＞0.05)。随着细胞分化程度的降低和淋巴结转移，p16表达水平亦下降(P＜0.05)。
图 1 肺腺癌p16蛋白免疫染色，胞浆棕红色(抗多克隆p16蛋白1∶40，LSAB染色×400)
Fig 1 Expression of p16 gene products was detected in adenocarcinoma of the lung by immunohistochemical staining (Anti-p16 polyclonal antibody 1∶40,LSAB staining×400.The cytoplasma was in brown-red.)
图 2 肺小细胞肺癌p16蛋白免疫染色，胞核着色(抗多克隆p16蛋白1∶40，LSAB染色×400)
Fig 2 Expression of p16 gene products was detected in small cell lung cancer by immunohistochemical staining (Anti-p16 polyclonal antibody 1∶40,LSAB staining×400.The nucleus was in brown.)
图 3 PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳
M：PCR Marker；A：正常模板；B，C，D：NSCLC组织样本；B样本中E2丢失
Fig 3 Amplification product of p16 gene product was detected in exon 2 by PCR technique
M:PCR marker; A:Normal template; B，C，D:NSCLC tissues samples; Deletion of p16?E2 in sample B
2.3 PCR扩增产物电泳结果 NSCLC中p16 E2的缺失率为45.2％，20例SCLC和14例癌旁正常肺组织中无E2缺失。高、中分化肺癌组织中E2的缺失率(31％)显著低于低分化的缺失率(76.9％)(P＜0.05)。有淋巴结转移组的缺失率显著高于无淋巴结转移组(P＜0.01)(表2)。
表 1 p16蛋白表达与肺癌病理生理特征的关系
Tab 1 Relationship between p16 protein expression and pathophysiological characteristics of lung cancer
| Characteristics |
Total cases
(N) |
Positive cases
(n) |
Positive rate
(％) |
| Histological types |
| Paracancerous lung tissue |
14 |
2 |
14.3 |
| Squamous cell carcinoma |
44 |
19 |
43.2 |
| Adenocarcinoma |
33 |
16 |
48.5 |
| Small cell lung cancer |
37 |
10 |
27.0 |
| Histological grades |
| Ⅰ＋Ⅱ |
52 |
29 |
55.8 |
| Ⅲ |
25 |
6 |
24 |
| Lymph node metastasis |
| ＋ |
28 |
6 |
21.4 |
| － |
49 |
29 |
59.2 |
表 2 p16 E2缺失与肺癌病理生理特征的关系
Tab 2 Relationship between deletion of p16?E2 and pathophysilogical characteristics of lung cancer
| Characteristics |
Total cases
(N) |
Positive cases
(n) |
Positive rate
(％) |
| Histological types |
| Paracancerous lung tissue |
14 |
0 |
0 |
| Non-small cell lung cancer |
42 |
19 |
45.2 |
| Small cell lung cancer |
20 |
0 |
0 |
| Histological grades |
| Ⅰ＋Ⅱ |
29 |
9 |
31.0 |
| Ⅲ |
13 |
10 |
76.9 |
| Lymph node metastasis |
| ＋ |
14 |
11 |
78.6 |
| － |
24 |
8 |
33.3 |
3 讨论
人p16基因又称MTS1或CDK4Ⅰ，位于9p21，由3个外显子和2个内含子组成，编码分子量15.845×103?u的蛋白质［5］。p16是细胞周期素依赖性激酶(CDK)的抑制蛋白，它和细胞周期素(cyclin)竞争与CDK4结合组成一个反馈调节圈，直接参与细胞周期调控，控制细胞由G1期进入S期，对细胞的生长呈负性调节作用［6］。它与许多恶性肿瘤的发生、发展相关［1］。
我们的研究结果显示，p16蛋白的表达与肺癌的组织学类型无关，SCLC中也有部分表达。14例正常癌旁肺组织只有2例p16蛋白阳性，该结果与Shapiro等［6］的结果相近。产生此现象的原因可能是：分化的正常肺组织中p16蛋白不表达或很低的表达；或正常组织中Rb基因抑制了p16蛋白的表达。由此可见，p16蛋白的表达调控较复杂。p16蛋白丢失主是由于p16外显子缺失所致，其中以E2最多见［7］，本组中p16 E2的缺失率为45.2％，该结果高于文献报道的30％左右缺失率［8］，这可能与石蜡包埋的组织中提取的DNA含量相对低，或正常细胞对p16基因缺失的污染有关。SCLC中无p16 E2的缺失表达可能是它与SCLC的形成无关，或由于Rb基因对p16的拮抗作用［9］。
在所检测的NSCLC中，伴有淋巴结转移的肺癌组织p16蛋白阳性表达率(21.4％)显著低于无转移的59.2％(P＜0.05)，p16 E2的缺失率以前者为高。淋巴结转移在临床上多属晚期。综上，我们认为p16失活参与NSCLC的发展过程，但它是NSCLC发展过程中的一个继发事件，还是一个恒定的事件，这有待于进一步研究。本资料结果还显示，p16基因及产物状态与NSCLC的肺癌细胞分化程度相关，因此，它可以作为临床判断NSCLC患者预后的参考指标。
参考文献
1，Tam SW,Shay JW.Differential expression and cell cycle regulation of the cyclin-dependent kinase 4 inhibitor p16 INK4.Cancer Res,1994,54(5)∶5816-5820.
2，Okamoto A,Hussain SP,Hagiwar K,et al.Mutation in the p16 INK4／MTS1／CDKN2,p15 INK4b／MTS2,and p18 genes in primary and metastatic lung cancer.Cancer Res,1995,55(1)∶1448-1456.
3，Shapiro GI,Park JE,Edwards CD,et al.Multiple mechanisms of p16 INK4 inactivation in non-small cell lung cancer cell lines.Cancer Res,1995,55(15)∶6200-6209.
4，Washimi O,Nagatatake M,Osada H,et al.In vivo occurrence of p16(MTS1) and p15(MTS2) alterations preferentially in non-small cell lung cancers.Cancer Res,1995,55(1)∶515-517.
5，Kamb A,Grusiv NA,Tartiqian SV,et al.A cell cycle regulator potentially involved in the genesis of many tumor types.Science,1994,264(15)∶436.
6，Shapiro GI,Edwards CD,Kobzik L,et al.Reciprocal Rb inactivation and p16 expression in primary lung cancers and cell lines.Cancer Res,1995,55(3)∶505-509.
7，Aikou Okamato,Elisa A,Market R.Mutation in the p16 INK4,p15 INK4 in primary and metastatic lung cancer.Cancer Res,1995,55(4)∶1448-1451.
8，Xiao S,Li DZ,Corson JM,et al.Codeletion of p15 and p16 genes in primary non-small cell lung carcinomas.Cancer Res,1995,55(15)∶2968-2971.
9，黄学胜，刘锟，王云杰，等.抑癌基因p16在肺癌中的表达及其临床意义.中国胸心血管外科临床杂志，1997，4(2)∶70-72.
收稿日期：1999-02-25
修回日期：1999-11-19
用户登录 
新用户注册