肺癌微转移的分子诊断研究进展

中国肺癌杂志 2000年第1期第3卷 综述

作者：宫友陵　周清华

单位：作者单位：宫友陵(华西医科大学附属第一医院胸外科　成都，610041)；周清华(华西医科大学附属第一医院胸外科　成都，610041)

　　肺癌是发病率和死亡率增长最快，对人类健康和生命威胁最大的恶性肿瘤。近年来，随着外科技术的发展和心血管外科技术在肺癌外科领域的应用，肺癌外科治疗的效果有所提高^［1，2］。同时，放疗、化疗方案的日趋成熟，基因、生物治疗技术的开展，使肺癌的综合治疗达到了一个新的水平^［3，4］。但令人遗憾的是，患者总的5年生存率并没有明显的提高。小细胞肺癌(SCLC)在确诊时约有50％～70％的患者已经出现远处转移，失去外科治疗的机会。虽然Ⅰ、Ⅱ期和部分Ⅲ期非小细胞肺癌(NSCLC)患者在确诊时有外科治疗指征，但术后5年生存率仅有50％～70％(Ⅰ、Ⅱ期)和20％～30％(Ⅲ期)。大部分患者在原发肿瘤切除后出现肿瘤复发，而肿瘤复发首先表现为癌细胞的转移^［5，6］。

　　肺癌的转移以血源性播散和淋巴源性播散两种方式为主。临床上主要通过无创性检查(CT、B超、骨扫描等)以及手术标本(包括淋巴结)的组织病理学诊断来检测肺癌的转移。但是这些方法并不能检测骨髓、淋巴结和外周循环中的隐性微转移(occult micrometastases,OMs)和循环中的肿瘤细胞(circulating tumor cells,CTCs)。1869年，Ashworth首先报道了1例肿瘤患者体内的CTCs^［7］。近年来，肿瘤微转移的分子诊断逐渐成为研究的热点。在对前列腺癌等肿瘤微转移的研究中，分子诊断技术已经得到较广泛的认同。Corey小组和Ghossein小组以前列腺特异抗原(prostate specific antigen,PSA)为分子标记，分别检测出前列腺癌患者骨髓中的微转移和周围循环中的CTCs^［8，9］。Mori等报道在胃肠道肿瘤和乳腺癌患者的骨髓和周围循环中检测出OMs和CTCs^［10］。在恶性黑色素瘤微转移的分子诊断研究中，Biegliek等发现在常规组织学检查阴性的淋巴结中，65％(117／180)的淋巴结被检测出OMs^［11］。迄今，有关肺癌微转移的分子诊断研究国外仅有少数报道，且主要处于一个探索的阶段。本文拟就近年来肺癌微转移的分子诊断现况综述如下。

　　1　检测肺癌微转移的常用分子标记

　　在肿瘤微转移的分子诊断研究中，标记物的含义与肿瘤标记物(tumor markers)不完全相同。前者是指正常组织细胞以及相应的肿瘤细胞所特有的，即具有组织特异性(tissue specificity)；而后者是指肿瘤组织和细胞所特有的。这类分子标记应具备2个特点：①特异性强，仅在待测的组织和来源于该组织的肿瘤细胞中表达，其他组织不表达；②敏感性高，在骨髓、淋巴结和体液中能稳定地被检测到。在肺癌微转移的研究中，常用的分子标记可分为以下几类。

　　1.1　组织特异性蛋白质(tissue specific proteins,TSPs)　组织细胞内大量存在着的蛋白质是细胞生命活动的基础，蛋白质的功能各不相同。在肺癌微转移的分子诊断研究中，TSPs是应用较为普遍的标记物。

　　1.1.1　细胞角蛋白家族(cytokeratins,CKs)　细胞角蛋白来源于上皮组织，是真核细胞的细胞骨架中间丝蛋白(intermediate filament protein)中最为复杂的一类。现在已知CK家族由分子量40×10³?u～68×10³?u不等的20个成员组成，即CK1～CK20。CKs一般在上皮组织中成对表达，特异性强。CKs的阳性表达已经成为上皮细胞及其肿瘤细胞较为敏感和特异的标记。单层上皮中，所有的分泌上皮(腺上皮)均表达CK8和CK18，多数细胞还表达CK19。因此在肺癌研究中常常以CK8，CK18和CK19作为分子标记。1994年，Passlick等应用抗CK18的单克隆抗体在肺癌患者的骨髓中检测出OMs^［12］。Pantel等以CK18为分子标记，在139例无远处转移的NSCLC患者的骨髓中检测到83例患者的骨髓微转移。即使在无淋巴结转移(PN₀)的患者中，CK18的检出率也达54.3％(38／70)^［13］。日本Kyushu大学和美国南加州大学的研究小组均以CK8和CK18为分子标记，检测NSCLC患者骨髓和淋巴结中的微转移。前者报道在Ⅰ期患者中，骨髓和淋巴结中标记物的表达率分别为70.5％(31／44)和9.4％(91／973)；后者在43位患者的骨髓中检测出17例微转移，而在出现临床转移灶的患者中，阳性表达率为100％(4／4)^{［14，15］}。

　　1.1.2　组织多肽抗原(tissue polypeptide antigen,TPA)　TPA是一种不含糖脂的蛋白质，即单链多肽。它由4个亚单位构成，分子量为2.0×10⁴～4.5×10⁴?u，其结构与CKs有较高的同源性，是CK8，CK18和CK19片段的复合物。TPA在细胞周期的S和M期合成，当细胞处于增殖分化时浓度较高。Buccheri等检测了104例NSCLC患者周围循环中的TPA，认为TPA的阳性表达与患者的淋巴结转移有一定相关性^［16］。多个小组的研究表明，TPA是肺癌患者疗效和预后的判断指标，连续检测TPA对监测肺癌的播散和肿瘤复发有较好的参考价值^［17］。

　　1.1.3　上皮特异性抗原(epithelial specific antigen,EPA)　EPA是上皮组织特异表达的蛋白质，位于细胞膜或胞浆中。某些EPA可以作为肺癌微转移的分子标记，如Ber-Ep4抗原。Ber-Ep4是一种多肽糖，2个亚单位的分子量分别为34×10³?u和49×10³?u。与其他上皮特异性抗原癌胚抗原(CEA)、上皮膜抗原(EMA)等不同的是它位于细胞表面。有人报道在NSCLC患者原发肿瘤中Ber-Ep4的表达率高达99％(87／88)，常规HE染色未发现淋巴结转移的肺癌患者中，Ber-Ep4的检出率为15.2％(11／72)^［12］。

　　1.2　组织特异性基因(tissue specific genes)　这一类基因与组织特异性蛋白质相类似，仅在上皮组织和上皮组织源的肿瘤组织中特异地表达。在最近的研究中，不少研究者以此类基因作为肺癌微转移诊断的分子标记。

　　1.2.1　肺泡表面蛋白mRNA　肺泡表面蛋白(surfactant proteins,SP)是肺泡表面活性物质中的主要蛋白质，由Ⅱ型肺泡细胞和Clora细胞合成分泌。SP均为疏水蛋白质，参与肺泡表面活性物质维持肺泡张力的功能，其家族成员(SP-A，B，C和D)在正常肺组织和NSCLC细胞系中的表达率很高，以SP-A的表达为主，但在SCLC细胞系中未发现表达^［18］。目前，SP的基因定位尚未明确。在肺癌患者微转移的检测中，Betz等以SP mRNA作为标记物进行研究。在13例M1期NSCLC患者的淋巴结中发现SP mRNA有84.6％(11／13)的表达率。在组织学检查阴性的淋巴结中，SP mRNA阳性检出率为55.5％(10／18)^［19］。

　　1.2.2　粘蛋白基因MUC1　粘蛋白(mucin)是一种细胞表面糖蛋白，主要存在于粘液中，由上皮组织的G细胞和某些粘膜下腺体分泌，是一类高分子量、多分散度的分子族，包括6个成员(mucin 1,2,3,4,5a和5b)。粘蛋白由多个基因编码。MUC1基因位于人染色体1q21-24区域，表达于多种上皮组织和上皮源的肿瘤组织中^［20］。有报道，MUC1在正常肺组织以及绝大多数NSCLC细胞系或实体瘤中均有较高表达，但不表达于正常的淋巴结组织中^{［21，22］}。在Salerno等的研究中，MUC1 mRNA作为分子标记，在88枚HE染色阴性的肺癌患者淋巴结中检测出33枚淋巴结中存在OMs，其敏感性可以达到10^－7，在对照组中未检测出MUC1 mRNA的阳性表达^［23］。

　　1.2.3　CKs mRNA　CKs已经在蛋白质水平被证明是较敏感和特异的鉴别上皮组织和上皮源性肿瘤细胞的标记物之一。在肺癌微转移的研究中，有研究者尝试以CKs mRNA作为分子标记来进行检测。Wulf等报道合成CK8，CK18和CK19 mRNA的特异引物，通过PCR技术检测肺癌患者的微转移^［24］。Krismann等的研究表明以CK19 mRNA为标记物可以检测出肺癌患者周围循环中的CTCs，其阳性检出率可以达到50％(25／50)^［25］。

　　1.3　癌基因和抑癌基因　现有的研究表明，癌基因／抑癌基因的缺失、突变及过量表达是最为特异的肿瘤标志物之一。但是缺乏稳定的表达是难以以此作为肿瘤微转移分子诊断标记物的原因。有人用PCR和放射性标记探针的原位杂交技术检测患者粪便中的结直肠癌细胞^［26］。这种方法可能运用于周围循环和骨髓OMs的检测。但在肺癌研究中，尚未有这方面的报道。

　　2　检测肺癌微转移的常用技术

　　2.1　免疫组织化学技术(immunohistochemical techniques,IHC)　IHC又称为免疫细胞化学技术(immunocytochemical techniques,ICC)，是指以显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位和定量的测定。在实验过程中，应注意标本的固定，抗原的修复，抗体的稀释与保存，孵育和设立对照等问题。在标记物抗体的选择上，多选用CK2(抗CKs和Ber-Ep4)和CAM5.2(抗CKs和TPA)等特异性抗体。在肺癌微转移的研究中，常用的方法主要是碱性磷酸酶－抗碱性磷酸酶法和亲合素-生物素-过氧化物酶复合物法。

　　2.1.1　.碱性磷酸酶－抗碱性磷酸酶法(alkaline phosphatase-anti alkaline phosphatase assay,APAAP)　在实验过程中，首先用碱性磷酸酶免疫动物(兔、鼠等)，再将酶与抗酶抗体结合形成复合物，通过酶的底物显色达到显示待测抗原的目的。APAAP法充分利用了第二抗体(桥抗体)的(Fab)₂段。一个Fab段与分子标记的特异性抗体结合，另一个Fab段与APAAP复合物的抗酶抗体结合，使其敏感性大大提高。

　　2.1.2　.亲合素－生物素－过氧化物酶复合物法(avidin-biotin-peroxidase complex assay,ABC)　ABC法是亲合组织化学(affinity histochemistry)技术中发展较为成熟的一种。它是利用亲合素与生物素高度的亲合力，把生物素化的特异性抗体与生物素结合的过氧化物酶连接起来，通过酶底物的显色达到检测的目的。ABC法的敏感性较APAAP法高，而且背景清晰，非特异性染色很淡。由于生物素是一种辅酶，是细胞代谢中产生的羧基载体，因此也存在出现假阳性的可能。

　　2.2　逆转录PCR技术(reverse transcriptase-PCR， RT-PCR)　PCR是一种选择性体外扩增DNA或RNA片段的方法，即通过引物延伸核酸的某段区域而进行的重复双向的DNA合成。在肺癌微转移的研究中，应用较多的是RT-PCR技术，即以某种特异的mRNA为分子标记，先在逆转录酶的作用下合成cDNA，然后通过寡核苷酸引物进行PCR扩增。实验成功的关键因素在于寡核苷酸引物的设计。引物的长度从100?bp至720?bp不等，但应该至少包含1个外显子序列。多条引物的设计有助于提高PCR扩增的敏感性。近年来，巢式引物(nested primer)被认为较一般引物更能避免基因组DNA扩增产物的干扰。它包含内、外两条引物序列。外引物首先扩增20～30个循环后，取小部分反应产物用内引物扩增15～25个循环；内引物位于cDNA内部使其互补序列存在于第一次扩增阶段的产物内并形成模板－引物复合体。这样的扩增通常更为成功。循环扩增后，电泳分离产物，通过Southern原位转移杂交，溴化乙锭染色等方法对产物进行鉴定。在具体应用中，RT-PCR技术的敏感性较IHC／ICC技术高。后两种技术均可能出现假阳性和假阴性结果。相比之下，PCR的实验程序较复杂。

　　3　肺癌微转移分子诊断研究的临床意义

　　迄今，对肺癌转移和术后肿瘤复发均无有效的治疗方法，原因是多方面的^［27］。如果能够尽早地诊断肿瘤的复发和转移，制定恰当的治疗方案，可以延长肺癌患者的无瘤生存期，提高存活率。常规组织学方法常常不能发现肿瘤的微转移，有可能延误治疗时机。对肺癌微转移的研究表明，微转移与患者的预后有一定的相关性，并可早期诊断肿瘤的复发和转移。Pantel等报道出现淋巴结微转移的N₀期NSCLC患者的无瘤生存期明显缩短^［13］。Maruyama等得到的结果与此类似，他发现淋巴结中无OMs的Ⅰ期患者的5年生存率为90.9％，而检测出淋巴结微转移的患者仅有64.4％的5年生存率^［14］。此外，有报道骨髓中检测出微转移与肿瘤的早期复发明显相关。无骨髓转移的患者的平均肿瘤复发时间为35.1月，而存在微转移的患者则为7.3月^［15］。Passlick等的研究结果表明，肿瘤复发与其组织类型无关，但检测出微转移的患者的肿瘤复发率较无微转移患者高出4.3倍^［12］。这些发现与其他实体瘤微转移分子诊断的研究结果一致。可以认为，肺癌微转移分子诊断是一个相对独立的预后指标，可以监测肺癌的复发和转移，并且有助于肺癌的临床治疗。

　　4　问题与展望

　　近年来，随着科学技术的进步，人们对肺癌发生、发展和转移机理的认识已经深入到分子水平。同时在临床上，对肺癌的治疗也更加完善成熟。但是，对肿瘤复发和转移的诊断并没有相应地发展。常规的组织病理学技术已经不能适应“治疗方案个体化”原则的要求^［2，27］。20世纪90年代初以来，肺癌微转移的分子诊断研究逐渐兴起，并显示出一定的临床应用价值。

　　分子诊断研究的先进性在于其检测的敏感性。但是较高的敏感性会导致假阳性结果的增多。分子诊断研究的关键是分子标记选择。由于人体骨髓、淋巴结和周围循环中细胞表型的多样性，许多标记物不能表现其特异性。Wulf等在研究中发现正常人群骨髓细胞中CK19 mRNA的表达率高达75％(12／16)^［24］。Krismann等报道对照组中CK19的表达率为20％^［25］。在已有的报道中，Ber-Ep4抗原，MUC1 mRNA显示了较好的特异性。由于肺癌的组织病理类型众多，细胞分化程度差别较大，因此缺乏公认的分子标记是广泛开展肺癌分子诊断的最大障碍。筛选敏感性和特异性均较高的分子标记将是今后工作的重点。

　　随着肺癌转移机理的新理论及新的实验技术的出现，更多、更新的方法会应用于肺癌转移分子诊断的研究中。而且，样本制备，避免沾染，鉴定和定量等实验细节的完善，将会使研究结果更加真实和可靠。最近，RT-PCR联合流式细胞计数、免疫细胞化学技术已经应用于前列腺癌微转移的分子诊断研究中，其敏感性和特异性均大大提高^{［28，29］}。这些技术在肺癌微转移中的应用仍需进一步探讨。

　　对肺癌微转移分子诊断研究的不断深入，将会影响现有的肺癌国际分期系统，使目前对肺癌的治疗更加及时和有效，减少肺癌复发和转移的可能性，提高肺癌患者的长期生存率。

　　本课题受国家自然科学基金(39470687)资助

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收稿日期：1999-12-20

修回日期：2000-01-10