肺癌组织中错配修复基因mRNA表达
中国肺癌杂志 2000年第1期第3卷 肺癌分子生物学研究
作者：陈国安 刘天菊 孙燕 李申德 杨德昌
单位：陈国安 杨德昌(西安医科大学附属第二医院呼吸科 710004)；刘天菊(美国密歇根大学医学院)；孙燕 李申德(中国医学科学院肿瘤医院)
关键词：肺肿瘤；错配修复基因／mRNA；微卫星
【摘要】目的 探讨DNA 错配修复(MMR)基因mRNA在肺癌组织中的表达及其与微卫星改变关系。方法 用RT-PCR和PCR－变性聚丙烯酰胺凝胶电泳－银染法，检测46例原发性肺癌组织中5种MMR基因mRNA表达及6种微卫星改变。结果 5种MMR基因mRNA在肺癌组织中表达降低的发生率为13.0％～32.6％，至少一种基因mRNA表达降低的发生率为58.7％(27／46)。39.1％(18／46)病例有至少2种基因mRNA下调。淋巴结转移阳性者的MMR基因mRNA表达降低发生率(20／27，74.1％)较淋巴结转移阴性者(7／19，36.8％)显著增高(P＜0.025)。mRNA表达下调在微卫星不稳定性(MSI)和／或杂合性丢失(LOH)(≥2个位点)阳性患者中占95.8％(23／24)，而在阴性患者中占18.2％(4／22)，两者差异显著(P＜0.005)。结论 肺癌组织中错配修复功能降低，且与微卫星改变有关，它在肺癌发病中可能有一定作用。
Mismatch repair gene mRNA expression in lung cancer tissues
CHEN Guoan,LIU Tianju,SUN Yan，LI Shende,Yang Dechang
(The Second Affiliated Hospital,Xi'an Medical University,Xi'an 710004,P.R.China)
【Abstract】Objective To explore the expression of mismatch repair (MMR) gene mRNA in lung cancer and the relationship between mRNA expression and microsatellite alterations.Methods The mRNA expression of five MMR genes and six microsatellite markers were detected in 46 primary lung cancer tissues by RT-PCR and PCR-denature polyacrylamide gel electrophoresis-silver staining methods.Results Reduced expression of five MMR gene mRNA was detected in 13.0％～32.6％ of all 46 primary lung cancer tissues,and 58.7％(27／46) had one or more MMR gene mRNA expression reduced and 39.1％(18／46) had two or more MMR gene mRNA expression reduced.The reduced expression of MMR gene mRNA was more frequent in patients with lymph node metastasis (20／27，74.1％) than those without lymph node metastasis (7／19，36.8％) (P＜0.025).Among microsatellite instability (MSI) and／or loss of heterozygosity (LOH) (at 2 or more loci) positive samples,95.8％(23／24) had decreased expression of MMR gene mRNA,but among MSI and／or LOH negative samples,only 18.2％(4／22) had reduced expression of MMR gene mRNA,the difference was significant (P＜0.005).Conclusion The function of MMR decreases in lung cancer tissue,and correlates with microsatellite alterations.MMR genes might play a role in carcinogenesis of lung cancer.
【Key words】Lung neoplasms Mismatch repair genes／mRNA Microsatellite
人类DNA错配修复(mismatch repair,MMR)系统至今已克隆了6种基因，它们是hMSH2，hMLH1，hPMS1，hPMS2，hMSH3和hMSH6(GTBP)，分别定位于染色体2p，3p，2q，7p，5q和2p上。现已证实遗传性家族性非息肉性结肠癌(HNPCC)与这些基因改变密切相关［1］。MMR基因功能缺陷是遗传不稳定或微卫星不稳定性(microsatellite instability,MSI)的重要机制［2］。有报道肺癌组织中存在MSI，但MSI的发生是否与MMR功能降低有关，尚有待研究［3］。我们对46例原发性肺癌组织中5种MMR基因mRNA表达进行了研究，以期阐明MMR基因mRNA在肺癌组织中的表达状态及其与MSI的关系。
1 材料和方法
1.1 组织标本 收集46例原发性肺癌组织及相应的远离癌组织的正常肺组织，患者均经病理确诊。标本取自1997年3月至5月中国医学科学院肿瘤医院，术后1～3?h内获得，置于－70℃保存。全组有鳞癌23例，腺癌19例，腺鳞癌3例，小细胞癌1例。男性36例，女性10例，年龄36～71岁。患者术前均未做过放疗或化疗，TNM分期为Ⅰ～ⅢA期。
1.2 MMR基因mRNA表达检测
1.2.1 引物设计 共检测5种MMR基因的mRNA表达，内参照为β-actin和β2-MG，引物序列［4］见表1，由上海生工生物公司合成。
表 1 MMR基因mRNA表达所用引物
Tab 1 Primers of MMR genes for mRNA expression
| Gene |
Primer sequence(5′3′) |
Size (bp) |
Annealing(℃) |
| hMSH2 |
CAGGCATGCTTGTGTTGAAG
TTTCTTCACCTGATAAAGCA |
546 |
57 |
| hMLH1 |
AGGACCTACTTCCAGCAACC
TTCTTCGTCCCAATTCACC |
622 |
60 |
| hPMS1 |
AAGCTGCTCTGTTAAAAGCG
GCACCAGCATCCAAGGAG |
133 |
50 |
| hPMS2 |
TGCATGCAGCGGATTTGGAAA
GAACCCCTCAGAATCCACGGA |
359 |
65 |
| hMSH6 |
CCCTCAGCCACCAAAGAAGCA
CTGCCACCACTTCCTCATCCC |
288 |
65 |
| β-actin |
GAAACTACCTTCAACTCCATC
GAAGCATTTGCGGTGGACGAT |
300 |
58 |
| β2-MG |
ACCCCCACTGAAAAAGATGA
ATCTTCAAACCTCCATGATG |
120 |
56 |
1.2.2 RT-PCR 在无RNase环境下用酚、氯仿常规提取组织RNA并行质量鉴定。用M-MLV逆转录酶逆转录成cDNA。30?μl PCR反应体系，MMR基因上下游引物各20?pmol，循环如下：变性94℃ 30?s，退火50～60℃ 30?s，延伸72℃ 50?sec，共28循环，最后72℃延伸7?min。
1.2.3 琼脂糖凝胶电泳及光密度薄层扫描 取PCR产物6?μl行1.5％琼脂糖凝胶电泳，然后光密度薄层扫描，以β-actin或β2-MG为内参，比较同一患者的癌组织和相应正常肺组织的光密度比值，若正常组织／内参∶癌组织／内参≥2，则认为癌组织mRNA表达降低［4］。
1.3 微卫星DNA检测 本组病例的MSI和杂合性丢失(LOH)检测方法及结果见已发表文献［5］。统计学处理用χ2检验。
2 结果
2.1 肺癌组织中MMR基因mRNA表达 肺癌组织中5种MMR基因mRNA表达较相应正常肺组织降低的发生率为13.0％～32.6％，hMSH2和hMLH1基因mRNA降低者较多，分别为32.6％(15／46)和26.0％(12／46)，hPMS1，hPMS2和hMSH6基因mRNA降低发生率分别为15.2％(7／46)，15.2％(7／46)和13.0％(6／46)(图1～3)。58.7％(27／46)病例存在至少1种基因的mRNA下调，39.1％(18／46)病例有至少2种基因mRNA下调。
图 1 MMR基因RT-PCR产物琼脂糖凝胶电泳图
Fig 1 The electrophoresed bands of RT-PCR products of
five MMR genes in agarose gels (M: PBR322／BstN1 marker)
图 2 RT-PCR产物琼脂糖凝胶电泳示hMSH2 mRNA表达
M：PBR322／MspI；N：正常肺组织；T：肺癌组织；N／T：光密度比值(正常肺组织／内参∶肺癌组织／内参)。T2、T3、T4显示mRNA表达降低。
Fig 2 Electrophoresis of RT-PCR products showing hMSH2 mRNA expression
M: PBR322／MspI marker,N: normal lung tissues,T:lung cancer tissues,N／T:rate of densitometry (normal lung tissues／control∶lung cancer tissues／control).T2,T3,T4 showed reduced expression.
2.2 MMR基因mRNA表达与肺癌临床病理关系 5种MMR基因中至少一种mRNA降低。淋巴结转移阳性患者MMR基因mRNA表达降低发生率为74.1％(20／27)，显著高于淋巴结转移阴性患者(36.8％，7／19)，两者差异显著，P＜0.025。鳞癌、低分化、ⅢA病例，MMR基因mRNA表达降低发生率较其他类型或分期更高，但无统计学差异。单个基因mRNA表达与肺癌临床病理及预后无明显相关性。
2.3 MMR基因mRNA表达与微卫星改变的关系 本组病例检测到MSI和／或LOH(≥2个位点)的共有24例，其中MMR基因mRNA表达下调的就有23例，占95.8％，而在MSI或LOH阴性者中mRNA表达下调仅占18.2％(4／22)，两者差异显著，χ2＝28.54，P＜0.005，说明mRNA表达下调与MSI和／或LOH的发生有关。
图 3 RT-PCR产物琼脂糖凝胶电泳示hPMS2和hMSH6 mRNA表达
M:PGEM-3zf(＋)／HaeⅢ。T1和T3的hPMS2表达降低，T2和T4的hMSH6表达降低。
Fig 3 Electrophoresis of RT-PCR products showing hPMS2 and hMSH6 expression
M:PGEM-3zf(＋)／HaeⅢ marker.hPMS2 in T1 and T3 showed reduced expression,hMSH6 in T2 and T4 showed reduced expression.
3 讨论
因错配修复(MMR)基因为管家基因，在正常组织中都有MMR基因mRNA表达。Wei等［6］用多重PCR方法分析脑胶质瘤，发现有42％(14／33)患者hMSH2基因mRNA表达降低，hMLH1为21％，hPMS1为18％，而hPMS2和hMSH6正常，mRNA表达与蛋白表达不完全一致。在分析头颈部肿瘤时，发现hMLH1和hMSH6 mRNA降低与头颈部肿瘤的发生有关［7］。Soliman等［8］报道hPMS1和hPMS2 mRNA降低与结肠癌发生有关，放化疗不影响mRNA水平。而肺癌组织中MMR基因mRNA表达情况鲜有报道。
我们的研究发现，在46例原发性肺癌中，有15例hMSH2 mRNA表达降低，占32.6％，hMLH1为26.0％，hPMS1和hPMS2均为15.2％，hMSH6为13.0％。有58.7％的病例存在至少1种MMR基因mRNA表达降低，39.1％病例有至少2种基因mRNA降低。这些说明肺癌组织中有一定程度的MMR基因mRNA表达降低。有淋巴结转移者的mRNA降低(≥1种基因)更明显。鳞癌、低分化癌及ⅢA期病例mRNA有降低趋势，但无统计学差异。
MMR基因mRNA表达下调与肿瘤组织中MSI和／或LOH发生有关，在微卫星改变者中，95.8％(23／24)有MMR基因mRNA表达(≥1种基因)降低。MMR基因mRNA相对表达水平反映了MMR总的修复能力，各自基因还有其独自的和必需的作用［7］。由此我们推测，MMR基因mRNA降低导致MMR功能缺陷，使微卫星改变增多，从而诱发了包括肺癌在内的肿瘤发生。
本课题受国家自然科学基金(39500065)资助
参考文献
1，Perucho M.Development of international criteria for the determination of microsatellite instability in colorectal cancer.Cancer Res,1998,58(1)∶24-25.
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3，Froudarakis ME,Sourvinos G,Fournel P,et al.Microsatellite instability and loss of heterozygosity at chromosomes 9 and 17 in non-small cell lung cancer.Chest,1998,113(4)∶1091-1094.
4，Wei Q,Xu X,Cheng L,et al.Simultaneous amplification of four DNA repair genes and β-actin in human lymphocytes by multiplex reverse transcriptase-PCR.Cancer Res,1995,55(11)∶5025-5029.
5，陈国安，孙燕，李申德，等.肺癌组织中微卫星DNA的改变.中华结核和呼吸杂志，1999，22(3)∶166-168.
6，Wei Q,Bondy ML,Mao Li,et al.Reduced expression of mismatch repair genes measured by multiplex reverse transcription-polymerase chain reaction in human gliomas.Cancer Res,1997,57(4)∶1673-1677.
7，Wei Q,Eicher SA,Guan Y,et al.Reduced expression of hMLH1 and hGTBP／hMSH6: a risk factor for head and neck cancer.Cancer Epidemiology,Biomarkers & Prevention,1998,7(2)∶309-314.
8，Soliman AS,Bondy ML,Guan Y,et al.Reduced expression of mismatch repair genes in colorectal cancer patients in Egypt.Int J Oncol,1998,12(6)∶1315-1319.
收稿日期：1999-10-22
修回日期：2000-02-02
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