Bax基因产物表达与肺癌预后关系的研究

中国肺癌杂志 2000年第3期第3卷 论著

作者：李潞　周清华　李虹　刘伦旭　邱萌　罗德云　易成　张尚福　成娘

单位：李潞　周清华　李虹　邱萌　罗德云　易成(610041　成都，华西医科大学附属第一医院肿瘤中心)；刘伦旭(胸外科)；张尚福　成娘(病理科)

关键词：非小细胞肺癌；Bax基因；预后

　　【摘要】　目的　探讨凋亡相关基因Bax的表达水平与肺癌发生、发展及预后的关系。方法　应用免疫组化链亲和素—生物素标记法(LSAB法)检测124例人非小细胞肺癌组织中Bax基因产物的表达水平。结果　肺癌组织中Bax基因产物的表达水平(53.76％)明显低于癌旁肺组织(75.51％)和正常肺组织(74.97％)(P＜0.01)。肺癌组织中Bax基因产物的表达水平与肺癌P-TNM分期、原发肿瘤大小及淋巴结转移状态有密切关系(P＜0.01或P＜0.05)，而与肺癌组织学类型、细胞分化程度、原发肿瘤部位、患者的性别、年龄及吸烟与否均无明显关系(P＞0.05)。肺癌患者Bax基因产物高表达组5年生存率(49.99％)明显高于低表达组(11.48％)(P＜0.01)。结论　Bax基因表达异常可能在肺癌发生、发展和预后中起重要作用。Bax基因可能参与了肺癌发生、发展和转移过程。

A study on the relationship between the expression of Bax gene products and prognosis in patients with human non-small cell lung cancer

LI Lu, ZHOU Qinghua, LI Hong, LIU Lunxu, QIU Meng, LUO Deyun, YI Cheng, ZHANG Shangfu, CHENG Niang. Cancer Center, The First University Hospital, West China University of Medical Sciences, Chengdu, Sichuan 610041, P.R.China

　　【Abstract】　Objective　To explore the relationship between the expression of Bax gene and oncogenesis, development and prognosis of lung cancer. Methods　The expression level of Bax gene products was detected in 124 human non-small cell lung cancer by immunohistochemistry labelled-streptavidin-biotin methods. Results　The expressional level of Bax products in lung cancer tissues (53.76％) was significantly lower than that in the normal tissues adjacent to lung cancer (75.51％) and normal lung tissues (74.97％)(P＜0.01). The expressional level of Bax products was closely related with P-TNM stage, the size of primary tumor and lymph node metastasis (P＜0.01 or P＜0.05); but not to histological classification, cell differentiation and site of the cancer, and age, sex of the patients and smoking or not (P＞0.05). The five-year survival rate in patients with high Bax expression was significantly higher than that in patients with low Bax expression (P＜0.01). Conclusion　Abnormal expression of Bax gene may play an important role in the oncogenesis, development and prognosis of lung cancer. Bax gene may be involved in the oncogenesis, development and metastasis of lung cancer.

　　【Key words】　Non-small cell lung cancer　　Bax gene　　Prognosis

　　This work was supported by a grant from the National Natual Sciences Foundation of China (to Zhou Qinghua) (No. 39670718).

　　Bax基因是1993年由Oltvai等用免疫沉淀等方法从人和鼠B细胞中发现的一种能与Bcl-2共沉淀的蛋白质，其分子量为21?ku，命名为Bax(Bcl-2 associated X protein)^［1］。Bax基因具有对抗Bcl-2抑制凋亡的作用^［2］。因此，Bax被认为是重要的促凋亡因子^［1～3］。已有证据表明Bax作为一个重要的促凋亡因子可能通过其对凋亡的调节而干预肿瘤的发生、发展及预后^［4～6］。我们应用免疫组化法检测124例人非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)组织中Bax基因产物的表达水平，并分析它与肺癌临床病理生理特征和预后的关系，现将结果报告如下。

　　1　材料与方法

　　1.1　材料　取自我院胸外科1991年5月至1993年12月间手术切除的部分NSCLC标本共124例，所有患者术前均未接受过放、化疗。标本用10％中性福尔马林固定，石蜡包埋，制成5?μm厚的切片。经HE染色病理确诊并按照WHO分类标准进行病理分型，其中鳞癌51例，腺癌50例，腺鳞癌23例；P-TNM分期按1997年国际抗癌联盟修订标准为：Ⅰ＋Ⅱ期43例，ⅢA＋ⅢB期81例。同时，以40例肺良性疾病作对照。

　　1.2.　免疫组化染色　采用链亲和素—生物素标记法(labelled streptavidin biotin method, LSAB)。生物素化羊抗鼠抗体及酶-链亲和素复合物均为DAKO公司原装产品。抗Bax多抗为美国Santa Cruze公司原装产品。病理切片经微波修复抗原，然后按LSAB法进行染色，具体方法参照说明书进行。每批染色均设立阴性空白对照及阳性对照。

　　1.3　结果判定　Bax蛋白主要定位于部分核膜、线粒体外膜及内质网膜^［7］，凡细胞浆显示棕黄色颗粒者为阳性。结果判定时，每张切片在400倍光镜下顺序找5～10个视野，每个视野数100～200个细胞，共计1000个细胞，计算出每张切片上肺癌细胞中Bax蛋白阳性表达的百分数。

　　1.4　统计学处理　采用t检验，F检验，单因素方差分析，对数秩检验，Kaplan-Meier生存曲线进行统计分析。在华西医科大学统计学教研室用美国SPSS统计软件及586微机进行处理。

　　2　结果

　　2.1　不同肺组织中Bax表达水平的比较　三组间Bax表达水平经F检验具有非常显著差异(P＜0.01)；两两比较：肺癌组织中Bax表达水平明显低于正常肺组织和癌旁肺组织(P＜0.01)，正常肺组织与癌旁肺组织间无显著差异(P＞0.05)(表1)。

表1　不同肺组织中Bax表达水平的比较

　　Tab 1　Comparison of Bax expression level

　　in the different pulmonary tissues

　　2.2　肺癌中Bax基因产物表达水平与临床病理生理特征的关系(表2)　肺癌组织中Bax基因产物表达水平与肺癌P-TNM分期、原发肿瘤大小及淋巴结转移状态有密切关系(P＜0.01或P＜0.05)；但与肺癌组织学类型、细胞分化程度、原发肿瘤部位、患者的性别、年龄及吸烟与否均无明显关系(P＞0.05)。

　　2.3　肺癌组织中Bax基因产物表达水平与术后生存率的关系　将肺癌患者分为Bax基因产物高表达组和低表达组，进行Kaplan-Meier生存曲线分析和对数秩检验。Bax基因产物高表达组5年生存率为49.99％，低表达组5年生存率为11.48％，两组间比较有非常显著差异(P＜0.01)(图1)。

表2　人NSCLC中Bax表达水平与临床病理生理特征的关系

　　Tab 2　The relationship between Bax expression level

　　and clinical physiopathologic characteristics in NSCLC

图1　肺癌患者中Bax高表达组(Group 2)和低表达组(Group 1)的生存(Kaplan-Meier)曲线

　　Fig 1　Kaplan-Meier survival curves of NSCLC patients with high (group 2) and low (group 1) Bax gene product expresions

　　3　讨论

　　人类Bax基因定位于染色体19q13.3～19q13.4，含6个外显子。其C端含有疏水氨基酸组成的跨膜结构域，表明产生的Bax蛋白为整合膜蛋白。该蛋白质分子还有7个丝氨酸／苏氨酸残基，可能为磷酸化位点^［1］。在人Bax基因的98～119和150～165残基上具有BH₁和BH₂高度同源的区域，该结构域对Bcl-2和Bax两类蛋白质形成同型或异型二聚体，在促细胞存活与死亡的过程中发挥独特作用。有研究表明，Bcl-2与Bax表达水平的高低与凋亡调控直接相关。细胞中Bax蛋白的高表达可抑制Bcl-2功能，加速细胞的凋亡^［3］。同时，已经证实抑癌基因p53诱导细胞凋亡也是由Bax介导的，而p53依赖的凋亡如果失活，能促进癌性转化和肿瘤的发展。因此，Bax可能通过对凋亡的介导干预肿瘤的发生和发展^［8］。Bargon等的研究表明，与正常的乳腺组织和培养的细胞系比较，乳腺癌细胞及其细胞系中的Bax蛋白表达水平明显低于正常乳腺细胞，且培养的正常细胞远比癌细胞对诱导性凋亡敏感。因此，他们认为凋亡的调控障碍参与了乳腺癌的发病机理，而凋亡的调控障碍至少部分涉及Bax与Bcl-2的相互作用失调^［4］。也有研究者用免疫组化方法检测119名乳腺癌转移患者中Bax蛋白表达水平，发现癌组织表达水平明显低于正常或原位癌组织，且发现Bax明显降低的病例存活期短，对化疗反应差，肿瘤发展迅速。这提示Bax可能作为检测乳腺癌患者预后的一个新指标^［5］。Binder等^［9］应用免疫组化检测122例原发乳腺癌Bax蛋白表达时发现，Bax蛋白与组织分化程度有关，而与肿瘤类型及大小无关。上述研究表明Bax至少部分干预乳腺癌的发生、发展，且与乳腺癌的病理特征有关。在胃癌、脑肿瘤及部分前列腺癌的研究中也发现Bax可能通过调控凋亡来干预肿瘤的发生、发展和预后。

　　迄今，有关NSCLC中Bax基因表达及其与肺癌临床病理生理特征和预后关系的研究尚未见报道。本研究应用免疫组化法检测124例人NSCLC中Bax的表达水平，并以正常肺组织及癌旁组织作对照。结果发现，肺癌组织中Bax表达水平明显低于正常及癌旁肺组织。肺癌组织中Bax基因产物的表达水平与肺癌P-TNM分期、原发肿瘤大小及淋巴结转移状态密切相关(P＜0.01或P＜0.05)；而与组织学类型，细胞分化程度，原发肿瘤部位，患者的性别、年龄及吸烟与否无明显关系(P＞0.05)。且肺癌患者Bax高表达组5年生存率明显高于低表达组(P＜0.01)。本研究结果表明，Bax基因作为一种促凋亡因子，可能参与肺癌的发生、发展和转移过程。Bax有望作为估计NSCLC患者预后的一个新指标。但其确切机理，以及Bax与Bcl-2之间的相互作用等问题，均有待于深入研究。

　　本研究受国家自然科学基金(39670718)资助

　　参考文献

　　1，Oltvai ZN, Milliman CL, Korsmeyer SJ. Bcl-2 heterodimerizes in vivo with a conserved homolog, Bax, that accelerates programmed cell death. Cell,1993,74(4)∶609-619.

　　2，Ben-Ezra JM, Kornstein MJ, Grimes MM, et al. Small cell carcinomas of lung express the Bcl-2 protein. Am J Pathol,1994,145(5)∶1036-1040.

　　3，Korsmeyer SJ, Shutter JR, Veis DJ, et al. Bcl-2／Bax: a rheostat that regulates an anti-oxidant pathway and cell death. Semin Cancer Biol,1993,4(6)∶327-332.

　　4，Bargous RC, Daniel PT, Mapara MY. Expression of the Bcl-2 gene family in normal and malignant breast tissue: low bax-alpha expression in tumor cells correlates with resistance towards apoptosis. Int J Cancer, 1995,60(6)∶854-859.

　　5，Krajewski S, Blomgvist C, Franssila K. Reduced expression of proapoptotic gene Bax is associated with poor response rates to combination chemotherapy and shorter survival in women with metastatic breast adenocarcinoma. Cancer Res, 1995, 55(19)∶4471-4478.

　　6，Kapucuolu N, Losi L, Eusebi V. Immunohistochemical localization of Bcl-2 and Bax proteins in situ and invasive duct breast carcinoma. Virchows Arch, 1997,430(1)∶17-22.

　　7，Krajewski S, Krajewska M, Shabaik A. Immunohistochemical determination of in vivo distribution of Bax, a dominant inhibitor of Bcl-2. Am J Pathol, 1994,145(6)∶1323-1336.

　　8，Mccurrach ME, Connor TM, Knudson CM. Bax-deficiency promotes drug resistance and oncogenic transformation by attenuating p53-dependent apoptosis. Proc Natl Acad Sci USA, 1997,94(6)∶2345-2349.

　　9，Binder C, Marx D, Binder L, et al. Expression of Bax in relation to Bcl-2 and other prediction parameters in breast cancer. Ann Oncol,1996,7(2)∶129-133.

(收稿：1999-08-18　　修回：1999-11-26)