肺癌患者癌组织和痰液细胞中p53和K-ras基因突变的研究

中国肺癌杂志 2000年第5期第3卷 论著

作者：李清泉　吴小军　胡克　丁续红　杨炯

单位：李清泉　吴小军　胡克　丁续红　杨炯(湖北医科大学附属第一医院呼吸内科　武汉，430060)

关键词：肺肿瘤；痰脱落细胞；p53基因；K-ras基因

　　【摘要】目的　检测肺癌组织和肺癌患者痰液脱落细胞中p53、K-ras基因突变情况，比较联合检测p53、K-ras和单一检测p53或K-ras基因在肺癌诊断中的价值。方法　应用PCR-SSCP－银染法检测了59例肺癌组织、癌旁肺组织、14例肺部良性病变肺组织及患者痰液脱落细胞中p53基因第5～8外显子、K-ras基因第1外显子突变。结果　肺癌组织中p53基因突变率为37.3％（22／59），痰液脱落细胞为33.9％(20／59），两组间比较无显著性差异(P＞0.05)。肺癌组织和患者痰液脱落细胞中K-ras基因突变率分别为23.7％（14／59）和20.3％(12／59)。肺良性病变肺组织和肺良性疾病患者痰液脱落细胞中均未检测到p53和K-ras基因突变。肺腺癌组织K-ras突变率(44％，11／25）显著高于其它类型的肺癌(8.8％，3／34)(P＜0.01)。吸烟肺癌患者p53突变率(48.7％，19／39）显著高于非吸烟肺癌患者(15％，3／20）(P＜0.01)。联合检测肺癌患者痰液脱落细胞p53和K-ras基因突变率为54.2％(32／59)，显著高于痰脱落细胞中33.9％的p53突变和20.3％的K-ras突变率。结论　联合检测肺癌患者痰液脱落细胞中p53和K-ras基因突变，有助于提高肺癌的检出率和诊断。

　　【中图分类号】R734.2

Study on the mutations of p53 and K-ras gene in the cancer tissues and sputum cells of patients with lung cancer

LI Qingquan,WU Xiaojun,HU Ke,DING Xuhong,YANG Jiong

　　(Respiratory Department,First Affliated Hospital of Hubei Medical University,Wuhan,Hubei 430060,P.R.China)

　　【Abstract】Objective　To investigate the mutations of p53 gene and K-ras gene in cancer tissues and sputum cells of patients with lung cancer,and to evaluate their values on detection of lung cancer.Methods　The mutation of exon 5-8 of p53 gene and exon 1 of K-ras gene in cancer tissues and sputum cells was detected in 59 patients with lung cancer and in 14 patients with benign pulmonary lesions as control by PCR-SSCP-AgNO₃ staining method.Results　The mutation rate of p53 was 37.3％(22／59) in cancer tissues,and 33.9％(20／59) in sputum cells.No significant difference was observed between the two groups (P＞0.05).The mutation rate of K-ras gene was 23.7％(14／59) and 20.3％(12／59) in cancer tissues and sputum cells respectively.No mutation of p53 and K-ras was detected both in benign pulmonary lesion tissues and sputum cells in patients with benign pulmonary diseases.The mutation rate of K-ras in adenocarcinoma (44％,11／25) was significantly higher than that in other histological classification of the cancer (8.8％,3／34) (P＜0.01).p53 mutation (48.7％) in smokers with lung cancer was significantly higher than that (15％) in nonsmokers with lung cancer (P＜0.01).The mutation rate (54.2％) of combination detection of p53 and K-ras in sputum cells was significantly higher than that of p53 (33.9％) or K-ras (20.3％) alone (P＜0.05).Conclusion　Combined detection of p53 and K-ras mutation in sputum cells of patients with lung cancer may help the diagnosis of lung cancer.

　　【Key words】Lung neoplasms　　Sputum cells　　p53 gene　　K-ras gene

　　p53基因为目前最热点的抑癌基因之一，作为“分子警察”的p53基因在众多的肿瘤中突变率高，成为众多肿瘤的分子标志物。K-ras基因在肺癌特别是肺腺癌中出现较高的突变率，众多的资料表明其为肺癌发生的早期事件，可能成为肺癌早期诊断的标志物。痰液中含有支气管肺组织的脱落细胞，肺癌或癌前病变产生的癌细胞或非典型细胞会随痰液咯出。本研究试图通过检测肺癌患者癌组织及痰液脱落细胞中p53和K-ras基因的突变情况，明确痰液中脱落细胞的遗传学改变能否反映组织癌变情况以及两种基因的联合检测是否更有利于肺癌的早期诊断，从而为肺癌高危人群的大量筛查提供理论依据。

　　1　材料与方法

　　1.1　资料　收集湖北医科大学附属第一医院胸外科和湖北省肿瘤医院胸体科1997年5月至1998年10月的肺癌手术标本及相应痰液各59份，患者中男48例，女11例，年龄35～72岁，平均59.3岁；鳞癌22例，腺癌25例，腺鳞癌2例，小细胞和大细胞及支气管肺泡癌各3例，类癌1例。另取肺结核2例、肺脓疡1例的病变组织及痰液与癌旁正常肺组织11例作为对照。标本取下后放入液氮罐中，再放入－70℃冰箱中，肿瘤分期按1997年制定的TNM系统进行，Ⅰ期12例，Ⅱ期30例，Ⅲ期16例，Ⅳ期1例。

　　1.2　痰液留取和DNA的提取　按参考文献1方法进行痰液和组织中DNA的提取。

　　1.3　PCR扩增

　　PCR引物：

　　p53　exon 5　5′ 5′　TTCCTCTTCCTGCAGTACTCC　3′

　　3′ 5′　GCCCCAGCTCTGCACCATCG　3′

　　exon 65′ 5′　CACTGATTGCTCTTAGGTCT　3′

　　3′ 5′　AGTTGCAAACCAGACCTCAGG　3′

　　exon 75′ 5′　TCTCCTAGGTTGGCTCTGAC　3′

　　3′ 5′　CAAGTGGCTCCTGACCTGGA　3′

　　exon 85′ 5′　CCTATCCTGAGTAGTGGTAA　3′

　　3′ 5′　GTCCTGCTTGCTTACCTCG　3′

　　以上引物分别扩增产生204、144、133、168?bp产物。

　　K-ras引物：

　　5′ 5′　ACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGACCT　3′

　　3′ 5′　TCAAAGAATGGTCCTGCACC　3′

　　扩增产物为157?bp。

　　反应程序　94℃变性1分钟，58℃?1分钟，72℃?2分钟，共30个循环，最后72℃延伸10分钟，4℃保存。

　　1.4　SSCP分析（single strand conformation polymorphism）　非变性聚丙烯酰胺凝胶的制备按参考文献2方法进行。取4?μl?PCR产物与等体积的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳加样缓冲液混合。混合液置于96℃水浴10分钟后，取出后快速放于已预冷的无水乙醇中。将上述混合液加入加样孔中，在电压150?V、4℃下电泳3～4小时后行硝酸银染色。

　　1.5　结果判定　经变性后扩增产物双链变成两条单链，两条单链的泳动位置与正常对照的两条单链位置有差异即认为存在点突变。

　　1.6　统计学方法　采用u检验。

　　2　结果

　　p53基因在肺癌组织中突变率为37.3％(22／59)，在痰液脱落细胞中为33.9％(20／59)，无显著性差异(P＞0.05)(表1)。K-ras基因在肺癌组织和痰液脱落细胞中的突变率分别为23.7％(14／59)和20.3％(12／59)，肺腺癌组织和痰液脱落细胞中的突变率分别为44％(11／25)和36％(9／25)，也无显著性差异(P＞0.05)；而在其它类型肺癌组织中K-ras突变率仅为8.8％(3／34)。全组中p53或K-ras任一基因突变者共计32例，占54.2％，显著高于两基因单独检测的阳性率(P＞0.05)。良性病变组织及相应痰液脱落细胞与癌旁正常组织中两基因均无突变。

表1　肺癌组织和相应痰液p53基因突变

　　Tab 1　The mutation of p53 in lung cancer tissues and sputums

　　Ⅰ、Ⅱ期肺癌p53基因突变率为35.7％（15／42），Ⅲ、Ⅳ期肺癌p53基因突变率为41.2％（7／17），两者无显著性差异；Ⅰ、Ⅱ期肺腺癌K-ras基因突变率为45.5％（10／22），Ⅲ、Ⅳ期肺腺癌K-ras 基因突变率为33.3％（1／3）。

　　吸烟肺癌患者的p53突变率为48.7％(19／39)，明显高于非吸烟患者15％(3／20)的突变率(P＜0.01)；吸烟肺腺癌患者的K-ras突变率为62.5％(10／16)，明显高于非吸烟患者11.1％(1／9)的突变率(P＜0.01)。

　　3　讨论

　　p53基因定位于17p13，突变的p53蛋白失去了G₀／G₁期的细胞停滞作用，对细胞增殖失去控制，它还能灭活野生型p53蛋白并诱导遗传不稳定。这些改变导致了细胞的恶性转化^［3］。p53基因在各型肺癌中突变率均较高，在以往的报道中肺鳞癌约为33％～68％；肺腺癌为28％～41％；小细胞癌为61％～87％^［4］。p53基因以5～8外显子突变最为多见。本研究中肺部良性组织无1例出现p53基因突变，而肺癌组织中突变率为37.3％(22／59)，相应的痰液脱落细胞中突变率为33.9％(20／59)，其中1例腺癌和1例大细胞癌患者的癌组织中p53基因发生突变，而痰液脱落细胞中p53未突变；痰液脱落细胞和肺癌组织中p53基因突变率比较，无统计学差异。有文献^［3，5］认为SSCP法与直接测序法相比，约有10％的假阴性，这也许是本研究中阳性率较低的原因之一。本研究中各期之间p53基因突变无显著性差异，提示p53基因突变可能是肺癌发生的早期事件。我们研究还发现吸烟的肺癌患者p53突变率与非吸烟肺癌患者有显著性差异。这说明吸烟在致p53基因突变中起着重要的作用。

　　K-ras基因若出现点突变，将引起基因扩增，从而导致了细胞的转化，最终引起肿瘤的发生。K-ras基因突变以第1外显子的12、13、61密码子为多见。在肺癌中，以12密码子点突变为主。其突变主要在肺腺癌中，突变率为30％～70％。Yakubouskaya等用增强PCR（EPCR）检测了37例肺癌患者，发现有18例（49％）痰液中K-ras基因突变^［6］，本研究中肺部良性组织无1例出现K-ras基因突变，25例肺腺癌中有11例出现突变，而痰中有9例出现突变，其它类型肺癌突变率仅为8.8％(13／34)，与文献报道基本相似^［7］。此外，吸烟肺腺癌患者的K-ras基因突变率显著高于未吸烟的患者，这说明吸烟与K-ras基因突变存在着密切的关系。

　　在我们的研究中，肺癌组织中p53基因点突变率为37.3％，K-ras基因的突变率为23.7％，任一单一基因检测在肺癌诊断中的价值均不大。但若将两种基因联合检测则阳性率达54.2％（32／59），明显高于单一基因的检测。

　　综上，我们认为检测痰液中p53和K-ras基因改变能反映其在肺组织中的改变情况，从而为肺癌高危人群的大量筛查提供理论依据。

　　本研究受湖北省“九五”攻关项目（961P1801）资助

　　参考文献

　　1，吴小军，戴宝生，胡克，等.不同的液化方法对痰液DNA提取的影响.湖北医科大学学报，1999,20（3）∶210-211.

　　2，Sambrook J,Fritsch EF,Maniatis T.金冬雁,黎子枫主译.分子克隆实验指南.第2版.北京:科学出版社,1996.325-330.

　　3，Liloglou T,Ross H,Prime W,et al.p53 gene aberrations in non-small-cell lung carcinomas from a smoking population.Br J Cancer,1997,75(8)∶1119-1124.

　　4，Murakami L,Fujiwara Y,Yamaolka N,et al.Detection of p53 gene mutations in cytopathology and biopsy specimens from patients with lung cancer.Am J Respir Crit Care Med,1996，154(6)∶1117-1123.

　　5，Top B,Mool WS,Klaver SG,et al.Comparative analysis of p53 gene mutations and protein accumulation in human non-small-cell lung cancer.Int J Cancer,1995,64(1)∶83-91.

　　6，Yakubouskaya MS,Spiegelman V,Luo FC,et al.High frequency of K-ras mutations in normal appearing lung tissues and sputum of patients with lung cancer.Int J Cancer,1995,63(5)∶810-814.

　　7，Li ZH,Zheng J,Weiss LM,et al.C-K-ras and p53 mutations occur very early in the adenocarcinoma of lung cancer.Am J Pathol,1994，144(2)∶303-309.

收稿日期：2000-01-25

修回日期：2000-05-05