肺癌分子生物学研究新进展
中国肺癌杂志 2000年第6期第3卷 会议述评
作者：汪蕙
单位：北京市结核病胸部肿瘤研究所 101149
【中图分类号】R734.2；Q7
第九届世界肺癌会议于2000年9月11～15日在日本东京隆重召开，来自世界各国的科学家集聚一堂，交流了肺癌研究新进展。肺癌分子生物学研究报告是整个会议的重要组成部分，内容广泛、深入，反映了世界肺癌分子生物学研究的动向和前沿。本次会议有关肺癌分子生物学研究的论文共有162篇，其中全会和专题讨论会报告论文27篇，肺癌分子生物学分会场报告论文68篇，墙报论文67篇。本次会议涉及肺癌分子生物学的内容主要有以下方面。
1 肺癌中染色体异常和微卫星不稳定
随着分子遗传学方法的改进，对染色体结构和功能的异常有了更多发现。Minna［1］报告用399个高分辨率的多型基因标记探针检测36个肺癌细胞系基因组杂合性缺失，结果显示每个肺癌细胞系平均有17～22个染色体区重复性等位缺失，非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌(SCLC)缺失区不同，60％杂合性缺失存在于22个不同区，13个区为SCLC最常见，7个为NSCLC，2个区为NSCLC和SCLC所共有。染色体长短臂最共同杂合缺失是在1p、3p、4p、4q、5q、8p、9p(p16)、9q、10p、10q、13q(Rb)、15q、17p(p53)、1gq、1qp、Xp和Xqa，众所周知，目前从染色体缺失区已克隆的与肺癌相关的抑癌基因仅有3p14上的FHIT／FRA3β和3p12上的U2020／DUTTI、9p上的p16、17q的p53、13q号染色体上的Rb、18号染色体上的Bcl-2。而会议报告中所显示肺癌存在如此多染色体缺失区说明肺癌还有许多定位于这些染色体缺失区上的抑癌基因没有被发现。从这些染色体缺失区克隆新的基因，对于阐明肺癌发生发展的分子机理，对于肺癌诊断和治疗都有着重要意义。
Takahashi等［2］报告指出，肺癌细胞系中存在染色体不稳定(chromosomal instability)通常与标记异倍体存在有关。在肺癌中大约40％肺癌细胞系中有有丝检查点不被修复。MAD有丝分裂检查点基因有低频率改变，而其它的一些有丝检查点的基因包括MAD2、BUB1、BUBR1和BUB3没有突变。因此引起肺癌中染色体不稳定的机理还不清楚，有待进一步研究。
微卫星DNA不稳定(microsatellite instability, MSI)和错配修复(mis match repair, MMR)在肺癌中可检测到。Takabe等［3］报告利用4个微卫星标记探针(D3S1228、D3S1286、D9S171、IFNA)甲基化特殊PCR法，检测7例NSCLC患者血浆DNA中至少一个位点有微卫星改变，发生率为71％(5／7)。Cha等［4］用20个微卫星标记探针研究28例NSCLC标本和相应的淋巴细胞DNA MSI和杂合缺失，甲基化特殊PCR和PCR-SSCP检测错配修复基因突变和甲基化，结果显示28例NSCLC中53.6％(15／28)有MSI。三核苷酸和四核苷酸探针检出率高于单核和二核苷酸。错配修复基因的突变未检查出。错配修复基因hMSH1的甲基化在MSI阳性和MSI阴性肿瘤中没有差异，结果指示该错配修复在NSCLC发生中可能不起重要作用。
2 肺癌表位遗传异常
在这次会议上有关肺癌发生和发展分子机理的研究方面，除了对研究肺癌的遗传改变的报告外，对肺癌表位遗传改变(epigenetic modification)有了更多新的认识。
癌发生发展中表位遗传改变是近年来重要的研究领域，大量研究已经证明了许多基因如抑癌基因失活或表达降低与其DNA promoter区CpG岛过度甲基化有关。本次会议有关肺癌基因的过度甲基化的研究报告有了更多的结果。Zchbaue-Müller等［5］报告107例NSCLC和相应正常肺组织中抑癌基因的过度甲基化研究，发现肺癌中9个基因有不正常的甲基化，86％NSCLC至少有一个基因过度甲基化，RARB有40％甲基化，Timp-3有26％。p16有25％，MGMT有21％，FHIT有20％，DAPK有19％，ECAD有18％，F14ARF有8％，GSTP有17％。正常组织未检查到这些基因的甲基化。107例标本中，检查到1个上述基因甲基化的占35％，2个甲基化占23％，3个甲基化占13％，4个甲基化占13％，5个基因甲基化占2％，说明NSCLC中存在频繁肿瘤抑癌基因甲基化。此外，DNA修复基因STP(S-transferase-pi)和MGMT(O6-methylguanine-DNA methyltransferase)，转移抑制基因，死亡相关蛋白激酶(DAP kinase)的甲基化在NSCLC中也有发现［6］。
Minna［7］报告87例SCLC标本中，72％(63／87)RARβ有promoter过度甲基化，大约13％NSCLC表现为多个基因的过度甲基化。Cohen等［8］报告了肺癌endothelin-1(EB-1)受体基因5′CpG岛过度甲基化可以促进ET1有丝分裂源的作用。Takabe等［3］报告在4例NSCLC切除的标本中检查到p16过度甲基化，但在患者血浆中DNA未检查到。这些研究报告说明肺癌中存在有很频繁的基因过度甲基化的异常。
肺癌有多阶段的发生发展过程，研究抑癌基因过度甲基化在肿瘤发生发展中的时间很重要。目前已知p16甲基化可在肺癌癌前病变中发现。Mao［9］报告了利用特异PCR甲基化(methylation-specific PCR)分析3个基因，即p16、GSTP、DAPK甲基化状态，发现肺癌气管刷洗细胞以及曾吸烟者的气管刷洗细胞中，这3个基因过度甲基化率从8％到20％以上。从大会报告提示出，肺癌中抑癌基因promoter CpG岛过度甲基化引起抑癌基因失活或表达降低，是肺癌发生发展的重要分子事件，并且在肺癌发生的早期已经出现。
3 早期肺癌和肺癌癌前病变的分子诊断
研究肺癌癌前病变的分子异常，是近年来肺癌分子病因研究的前沿，对于了解肺癌发生的分子机理有着重要理论意义，而且对于肺癌的早期诊断和预防有着重要实用价值。这次肺癌会议的报告反映了该领域近年来的研究成果。
Gazdar［10］报告了利用荧光纤维支气管镜取材气道标本，进行肺癌癌前病变的研究，吸烟者气道上皮有3p、9p缺失，吸烟停止后其上皮增生紊乱(dysplasia)和分子异常改变持续保持，且为不可逆的。男性吸烟者中中心气道异常更为显著。鳞癌癌前病变包括了气管上皮相连续的改变阶段(metaplasia，hyperplasia，dysplasia)，而腺癌主要是周围型，癌前病变为非典型腺样增生(atypical adenomatous hyperplasia)，SCLC还没有发现癌前病变，SCLC来源于神经内分泌细胞，可能直接发生癌，在致癌物作用下没有先趋组织学的异常阶段。
早在1982年Dr. Wang Pen发现3p缺失与肺癌关系非常密切。随着从3p上克隆的基因探针的增多，研究3p缺失区有可能更为明确，继而对3p缺失与肺癌临床病理的关系进行研究。3p作为肺癌患者预后判断的分子标记，大多数作者报告持否定结果，认为3p异常是与肺癌早期有关的事件。在3p14.2克隆了FHIT／FRA3b和克隆了U2020／DUTTI抑癌基因。肺癌癌前病变中发现3p缺失，引起了人们的极大关注，研究也比较多。这次会议对3p缺失与肺癌癌前病变关系的研究报告突出了该领域研究进展。Minna［1］报告了从66个原发肺癌及癌前病变标本取材检测3p缺失区，肺癌中96％有3p缺失，癌前病变中有38％。在吸烟肺癌和癌个体都发现了3p缺失区。3p等位缺失在肺癌癌前病变中有多个不相连的3p杂合缺失区。Mao［9］报告了3p14.2克隆的FHIT基因在癌前病变中表达降低。从372例慢性吸烟者气道标本中取材，23％(86／372)有FHIT基因表达降低或缺失。86例表达降低的气道个体中在一个穿刺部位至少有FHIT缺失表现占43％(37／86)。以上研究表明，吸烟引起3p缺失或FHIT基因表达异常是肺癌发生的最初事件。此外，在肺癌中8p21-23区杂合缺失发生率很高(NSCLC 81％～100％，SCLC 86％)，在癌前病变中，中等不正常上皮组织中15％有8p缺失，50％有增生紊乱(dysplastic)，原位癌中有92％。而正常上皮组织中未发现8p缺失。8p缺失晚于3p、9p缺失［7］。Bunn［11］报告中也指出肺癌发生的不同阶段中3p缺失先于9p异常，随后为p53异常，Rb于后。
随着对肺癌中分子异常的研究，发现了一些基因异常在肺癌中明显的异质性，例如：抑癌基因p53突变率在NSCLC中约为50％，也就是说还有50％的患者没有p53突变存在，提示突变的p53基因是否可能影响到肿瘤的进展(如转移等)，肺癌患者的基因标记是否可能判断预后?在这方面已进行了大量研究，但研究结果出现了矛盾。对肺癌中存在有同一个基因异常的患者，有的作者报告这种基因异常与患者存活期短相关，有的结果则相反，甚至有的结果显示是良好预后的标记。这次会议有关基因异常与判断预后的研究占了较多篇幅，涉及到的基因颇多，如：Fujino等［12］报告检测41例Ⅰ期NSCLC中上皮生长因子受体(EGFR)高表达与患者生存有关。EGFR阳性者5年生存率为66.7％，EGFR阴性者为83.3％。结论是高EGFR水平表达是肺癌预后不良指标。沈浩报告对48例NSCLC切除的Ⅰ期肺癌标本免疫组化染色，p53蛋白阳性者5年生存率为72％(18／25)。Torres报告端粒酶活性与NSCLC病程进展有关，66例NSCLC阳性率为80％(50／66)。4年随访结果显示，端粒酶阳性者存活64％，阴性者存活87％，但其差异无统计学意义。
此外，有报告提示HLA-A2、HLA-1、HLA-DR与肺癌患者存活相关。检测43例肺癌患者血样DNA印迹杂交证明L-myc有SS表型的肺癌患者与远处转移相关。Selvaggi等［13］报告120例NSCLC切除癌标本，免疫组化染色检测Her2／neu结果证明，阳性率为16％(21／120)，阳性肿瘤患者5年生存率为6％，阴性肿瘤患者为43％，两组生存率有显著性差异(P＜0.01)。Nomnura等报告用免疫组化检查215例NSCLC p27表达和Ki-67(生长因子)，p27的阳性率为13％(25／207)。p27阳性肿瘤患者5年生存率为38％，阴性者5年生存率为68％(P＝0.01)。Ki-67阳性肿瘤患者5年生存率为47％，阴性者为78％(P＝0.01)。Brechot等［14］报告86例NSCLC用免疫组化检测Rb、p16、Bcl-2表达，结果显示它们不能预测患者复发和转移。Sanchez等［15］报告检测136例NSCLC切除癌标本K-ras突变，突变率为33％(45／136)，K-ras突变肿瘤患者无瘤存活41个月，无K-ras突变者无瘤存活65.8个月。
抑癌基因p53异常在肺癌中有很高的发生率(50％NSCLC和90％SCLC)和具有多种重要抑癌功能，因此，是治疗和诊断肺癌的一个重要靶点。过去对p53异常与肺癌病理临床相关性已进行了大量研究。此次会议对p53基因在肺癌诊断和治疗的作用研究仍是很重要的内容。p53基因异常是否能成为肺癌预后的基因标记，以往的研究结果是矛盾的。这次肺癌大会上一些作者报告的结果以及讨论也不能得出肯定或否定的结论。有作者综合多篇文献报告，提示一些有意义的结果。Mitsudomi等［16］综合43篇有关p53基因异常和预后相关性的报告，肺癌中p53异常率为46％(2?143／4?664)，腺癌34％，鳞癌52％。p53异常与无异常患者5年生存率的差异是12％(P＝0.002?2)，肺腺癌中p53异常负面效果更不好，5年生存率差异为30％(P＜0.001)，而鳞癌中p53异常无指示预后不好。Paesmans通过对56项研究结果进行综合评价的基础上，综合归纳各家研究中条件相近的与预后有关的11项因素，总结了p53异常对判断肺癌预后的意义。以相关危险度作为判断指标，11项中仅肺腺癌p53异常与预后不良相关，相关危险度＞2.24，提示肺腺癌患者中p53突变是患者存活短的基因标记。其余的各项，如病理分期、鳞癌等，相关危险度在2以下。
这次会议就p53异常作为预后标记研究出现的矛盾结果进行了讨论。与会者认为，实验条件(包括技术条件)、所用方法、试剂以及随访率和准确性等因素都会影响结果。Monzo用酵母功能实验鉴别p53 COOH-Terminal domain突变，68例NSCLC中50％(34／68)的标本有突变集落出现，这些患者无瘤存活33个月，而无集落形成者无瘤存活43个月。由于C-Termino突变，也可影响到p21、bax基因和IGF-B13转录，对患者产生负面影响，是影响患者存活的原因。
肺癌患者血清中可检测到自主性p53抗体。近年来一些作者报告其阳性率大约为20％。通常血清抗体水平与患者肿瘤负荷相关，可用于检测患者治疗效果和复发转移，对于判断患者预后可能有一定意义。有作者报告了早期肺癌患者血清中可检查到血清抗体，因而对于监测高危人群和早期发现肺癌患者可能有较好的前景。本次会议上，Daniel等［17］报告了检测41例NSCLC和14例SCLC血清自主性p53抗体结果，治疗前血清抗体阳性率为29％。11例NSCLC为阳性，阳性率为26.8％，5例SCLC为阳性，阳性率为35.7％。16例患者经2周期化疗后，2例病情稳定的患者抗体检测为阴性。结果提示检测血清抗体可能对估计预后有一定意义。Hsudomi等报告检测了188例NSCLC患者自主性p53抗体，阳性率为18％(34／188)，但他们认为血清p53自主抗体与预后无关。
肺癌的发生发展为多阶段过程和多种基因起作用，会议报告中联合检测多个基因异常作为肺癌预后的指标，也引起了关注。
对166例NSCLC Ⅰ～ⅢA期石蜡切片检测EGFR、C-erbβ-2、MMP-2、MMP-9、p53、Bcl-2、CD34等指标，结果显示：MMP-9、Bcl-2表达增加与微血管计数和癌基因是独立的预后不良指标，而同一肿瘤中MMP-9和EGFR同时表达与预后不良有关。
有关细胞骨架、细胞粘附分子、细胞间质以及血管生成等在肺癌患者转移中的作用也是近年来肺癌研究的热点。本次会议上也有了一些相关的报告，但结果不尽相同。Sugio对273例NSCLC患者癌标本联合检测p53、K-ras、p27、p16、细胞粘附分子(E-cadherin，β-catenin)、moleetle、anti-angiogenic表达，结果显示，p53、p27、β-catenin、TSP是肺癌预后不良指标。Sramasami报告粘附因子E-cadherin、β-catenin等不影响完全切除肺癌患者的存活，而高表达CD44患者与不良的预后明显相关。Skase报告331例NSCLC Cadherin-catenin表达与临床病理因素的相关性，cadherin减低为42％，β-catenin为37％，E-cadherin与淋巴结转移相关(P＝0.019)，在鳞癌特别显著(P＝0.002)，β-catenin表达与患者存活短明显相关。Guillo报告tubulin突变与肺癌患者预后不良有关。Barradas等［18］报告638例肺癌血样本检测cyfra-21-2(cy21)，结果显示每毫升cy21值大于3.3?ng的患者预后不良。Edwards等［19］检测76例肺癌切除石蜡包埋切片微血管，MVD平均值为23，而MVD＞23的肿瘤患者预后不良。
我国学者周清华等［20］应用DNA印迹杂交技术检测52例人肺癌中nm23基因缺失，并探讨nm23基因缺失与肺癌临床病理生理特征的关系。结果显示：29.8％的NSCLC存在nm23-H1基因缺失，伴淋巴结和远处转移者nm23-H1基因缺失率为42.85％，不伴转移者为8.33％；低分化癌nm23-H1缺失率为45.45％，中－高分化肺癌为13.33％；nm23-H1基因缺失与肺癌TNM分期，原发肿瘤大小及部位，患者年龄及性别等均无明显关系。研究结果表明nm23基因缺失与肺癌转移和细胞分化程度有密切关系。
这次会议对肺癌中基因标记异常作为肺癌患者预后指标尚无明确的结论。本次大会报告的内容广泛，除上述提到的以外，对SCLC的分子生物学特点、SCLC与NSCLC的细胞分子生物学差异有深入的报告。总之，这次大会反映了近年来肺癌细胞分子生物学研究所取得的进展，为今后的研究指明了方向。这次肺癌会议报告反映出基础与临床相结合的研究趋势，随着对肺癌的发生发展机理的认识，基础研究的成果应用到治疗和诊断中已势在必然。针对各种靶部位设计的治疗模式和药物已显露出可观的前景，在肺癌诊断方面，也同样有着很好的前景。
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收稿日期：2000-11-29
修回日期：2000-12-09
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