肺癌浸润淋巴细胞的分离及增殖研究

中国肺癌杂志 2000年第6期第3卷 论著

作者：张毅　赖百塘　李世业　汪蕙　湛秀萍　刘桂枝　王月

单位：张毅　李世业(北京市结核病胸部肿瘤研究所医院胸外科　101149)；赖百塘　汪蕙　湛秀萍　刘桂枝　王月(细胞生物室)

关键词：肺肿瘤；肿瘤浸润淋巴细胞；白细胞介素-2；过继免疫治疗

　　【摘要】目的　从肺癌患者手术切除的肿瘤组织中分离出肺癌浸润淋巴细胞(TIL)，经rIL-2体外激活培养，研究TIL体外分离、增殖的条件和特点。方法　应用机械、酶消化和不连续密度梯度离心法从67例肺癌患者手术切除的实体瘤中分离得到TIL，其中34例TIL放入10％人AB血清RPMI-1640液中培养。结果　本组67例标本中，每克瘤组织获得的TIL平均为6.84×10⁶个。在培养的34例TIL中，第7～28天之间增殖最旺盛，以后增殖活性降低，数量减少。增殖达到10⁹以上有17例，可回输率为50％。Ⅰ期患者分离获取TIL数明显多于Ⅲ、Ⅳ期，但在增殖倍数上无显著性差异；鳞癌与腺癌分离获取TIL数无显著性差异，但腺癌TIL扩增明显比鳞癌好。结论　TIL能有效地分离和增殖，并已具备了应用于临床治疗肺癌的条件。

　　【中图分类号】R73-35

Experimental research of tumor infiltrating lymphocytes for treatment of lung cancer

ZHANG Yi,LAI Baitang,LI Shiye,WANG Hui,ZHAN Xiuping,LIU Guizhi,WANG Yue

　　(Department of Thoracic Surgery,Beijing Thoracic Tumor and Tuberculosis Hospital(Institute),Beijing 101149,P.R.China)

　　【Abstract】Objective　To explore the conditions and characterization of tumor infiltrating lymphocytes(TILs) isolation and expansion.Methods　TILs were separated from tissue samples which obtained from the surgically removed tumor of 67 patients with lung cancer by mechanic and enzyme digestion and discontinuous density Ficoll-paque gradient centrifugation ways.TILs from 34 patients were incubated with 10％ human type AB serum RPMI-1640 in vitro.Results　The average number of TIL was 6.84×10⁶ per gram tumor tissue.The number of TIL from patients in stage Ⅰ was greater than that from patients in stage Ⅲ and Ⅳ,but with no difference in expanding among them.The number of TIL from patients with adenocarcinoma was similar to that with squamous cell carcinoma,but TIL isolated from adenocarcinoma expanded much more faster than that from squamous cell carcinoma.TIL expanded rapidly during 7-28 days and most of them appeared the maximum expansion within 35 days.TIL incubated from 17 of 34 patients had expanded exceeding 1×10⁹,so the rate of infusion was 50％.Conclusion　The results suggest TIL can be effectively separated from the tumor and expanded in vitro and these provide the basis for adoptive immunotherapy with TIL in the treatment of lung cancer.

　　【Key words】Lung neoplasms　　Tumor infiltrating lymphocyte(TIL) 　　Interleukin 2(IL-2) 　　Adoptive immunotherapy(AIT)

　　肺癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，在世界上许多国家肺癌发病率和死亡率呈上升趋势。近年来，肿瘤生物疗法的发展，为肺癌的临床治疗开辟了新途径。肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocytes,TIL)是继LAK细胞之后又一种新的抗肿瘤效应细胞，由于其抗瘤活性强，回输后能特异性聚集于肿瘤部位，故受到更多的关注。1988年，Rosenberg等首次应用TIL治疗20例转移性黑色素瘤，取得较好疗效^［1］。1996年，Ratto研究小组^［2］用TIL协同大剂量IL-2治疗肺癌，发现Ⅲ期患者生存期明显提高，而且TIL能与化疗、放疗联合应用，无明显毒副反应。

　　本研究的目的是从肺癌患者手术切除的肿瘤组织中分离出TIL，经rIL-2体外激活培养，观察TIL体外分离、增殖的条件和特点。

　　1　材料与方法

　　1.1　研究对象　所有病例均取自我院手术治疗的肺癌患者，共67例。男性51例，女性16例；年龄29～78岁，平均年龄55.0岁。其中鳞癌35例，腺癌25例，腺鳞癌4例，小细胞癌(SCLC)3例。据1997年国际抗癌组织联盟(UICC)分期标准：Ⅰ期24例，Ⅱ期3例，ⅢA期31例，ⅢB期5例，Ⅳ期4例。

　　1.2　方法

　　1.2.1　TIL的分离　取手术切除的近外周瘤组织，约10?g，在无菌条件下去除肺、坏死组织及结缔组织，剪成0.5～1?mm³左右的组织块，用三种方法消化：4例标本置于0.25％ Trypsin和0.02％ EDTA中；8例置于0.05％Ⅳ型胶原酶和0.002％ DNase Ⅰ中；55例均放入含0.05％Ⅳ型胶原酶、0.06％透明质酸酶和0.001％DNase Ⅰ中，其中3例于4℃磁性搅拌冷消化约20小时，52例于37℃磁性搅拌暖消化4小时。消化后悬液用100目不锈钢网过滤，经不连续密度梯度离心，分别收集淋巴细胞和肿瘤细胞，肿瘤细胞置液氮中冻存，淋巴细胞(TIL)用于培养。

　　1.2.2　TIL的培养扩增　为便于统计，将用三种酶消化分离得到的55例TIL中随机选取34例放入含10％人AB血清和抗菌素的RPMI-1640培养液中，加20％正常人同血型LAK细胞培养上清，TIL浓度为1×10⁶／ml，IL-2 1000?U／ml，置于37℃，5％CO₂暖箱中培养。根据细胞增殖情况，3～5天换液传代一次，补充新的培养基及IL-2等。

　　1.2.3.　统计学处理方法　结果用均数±标准差表示；t检验比较两样本均数的显著性差异；卡方(χ²)检验比较计数资料间的显著性差异。

　　2　结果

　　2.1　TIL分离收获情况　67例患者手术中所取标本平均瘤重10.9?g，最大27.4?g，最小1.0?g。

　　2.1.1　不同酶消化对TIL分离的影响　三种酶消化方法结果比较，用0.05％Ⅳ型胶原酶和0.002％DNaseⅠ消化或0.05％Ⅳ型胶原酶、0.06％透明质酸酶和0.001％DNase Ⅰ消化，收获的淋巴细胞数无显著性差异(分别为0.742×10⁷／g±0.70×10⁷／g和0.724×10⁷／g±0.61×10⁷／g，P＞0.05)，且均显著高于用0.25％Trypsin和0.02％EDTA 消化法获得的0.014×10⁷／g±0.011×10⁷／g(P＜0.05)。

　　而酶消化的温度和时间对TIL分离及活性的影响不大(P＞0.05)。

　　2.1.2　TIL回收率　随机选取38例标本在酶消化后的细胞悬液分层前计TIL总数，与分层后收获TIL数对比，每一例分别计算回收率。得出回收率最大97.5％，最小3.3％，38例平均回收率为19.80％±18.54％，可见标本之间TIL回收率差异很大。其中鳞癌21例，平均回收率20.74％±15.08％；腺癌13例，平均回收率 21.99％±24.16％。经t检验，两者之间无显著性差异。

　　2.1.3　不同病理类型与TIL收获的关系　全组有63例用Ⅳ型胶原酶消化的方法分离TIL与癌细胞后，不同病理类型与TIL收获间关系见表1。以每克瘤组织获取的淋巴细胞数计算，34例鳞癌中38.2％在10⁷以上；23例腺癌中，有17.4％在10⁷以上。经卡方检验，鳞癌与腺癌间TIL收获数目无显著性差异(P＞0.05)。

　　2.1.4　不同分期与TIL收获的关系　表2显示，Ⅰ期22例中，每克瘤组织分离获得淋巴细胞数50％在10⁷以上；Ⅲ、Ⅳ期38例中，仅18.4％在10⁷以上。经卡方检验，Ⅰ期获取TIL数明显多于Ⅲ、Ⅳ期(P＜0.05)。

表 1　每克瘤组织获取TIL数与病理类型的关系

　　Tab 1　The number of TIL per gram tumor tissue and pathologic type

表 2　每克瘤组织获取TIL数与分期的关系

　　Tab 2　The number of TIL per gram tumor tissue and tumor stages

　　2.2　TIL增殖特征　培养第2～3天时，大部分肿瘤细胞贴壁，TIL增殖不明显， 5～7天时TIL形态变大，第7天以后TIL增殖明显，且形态各异，圆形、椭圆形、长条形、伸出伪足的不规则形等，2～4天即扩增一倍，持续到第30天左右，以后生长速度减慢，逐渐细胞核固缩，死亡。

　　2.2.1　TIL培养增殖情况　用正常人同血型LAK细胞培养上清的34例患者，其TIL在第7～28天之间增殖最旺盛，以后增殖活性降低，数量减少。其中1例患者TIL在培养第76天时达到最高峰，数量为2.28×10¹¹，较接种时增殖了2?533.33倍，表明少数TIL活性持续时间长，可长期培养扩增，多次回输。

　　分析34例TIL在培养期间的最高增殖倍数，50％(17／34)在10～50倍之间；14.7％(5／34)在50倍以上；而10倍以下占35.3％(12／34)，其中包括未增殖的两例。除去两例无增殖者外，其余32例患者中68.8％(22／32)TIL达到最高增殖倍数时间出现在14～28天内。

　　TIL达到有效回输数量一般在10⁹以上，在此34例患者TIL培养过程中，能达到10⁹以上的有17例，可回输率为50％。其中鳞癌7例，腺癌9例，SCLC 1例；Ⅰ期6例，Ⅱ期1例，ⅢA期7例，Ⅳ期3例。17例中16例在32天内达10⁹，11例（64.7％)TIL扩增达20倍以上。不同培养时间TIL增殖的倍数，在35天内，有20例(58.8％)最高增殖倍数达10倍以上； 58天内，22例(64.7％)在10倍以上，大部分TIL增殖高峰在35天以内，时间延长细胞增殖减慢。

　　2.2.2　不同病理类型、不同分期对TIL增殖倍数的影响　34例TIL按不同病理类型，观察所增殖的倍数(表3)。鳞癌19例中，42.1％(8／19)扩增10倍以上，而腺癌14例中92.9％(13／14)大于10倍，且最高增殖倍数大于100倍的4例均为腺癌。以10倍为界，经χ²检验，腺癌TIL扩增明显比鳞癌好(P＜0.01)。

表 3　不同病理类型的TIL增殖倍数情况

　　Tab 3　TIL expansion multiple and pathologic types

　　按不同分期观察TIL培养过程中的最高增殖倍数情况(表4)。Ⅰ期11例中，63.6％(7/11)TIL增殖10倍以上，Ⅲ期和Ⅳ期共21例，61.9％(13／21)在10倍以上。经χ²检验，不同分期对TIL增殖的影响无显著性差异(P＞0.05)，即Ⅰ期与Ⅲ、Ⅳ期肿瘤分离出的TIL在增殖倍数上无显著性差异。

表 4　不同分期的TIL增殖倍数情况

Tab 4　TIL expansion multiple and tumor stage

　　3　讨论

　　肺癌的治疗除手术、化疗和放疗外，生物免疫治疗也是一个重要的手段，其中TIL目前备受瞩目。TIL抗瘤活性高于LAK细胞^［3］，并有一定的靶细胞特异性^［2］，能与IL-2协同作用^［4］。从目前报道的临床治疗效果看，TIL对黑色素瘤及肾癌疗效显著，对肺癌也有较好的疗效。我们就67例肺癌手术切除标本中分离的TIL加以研究，了解TIL体外分离、增殖的条件和特点。

　　自80年代以后，Rosenberg等^［5］和Whiteside等^［6］均建立了新的TIL分离制备技术，Vose及Mule等加以改进，使TIL能长期在体外培养扩增。我们应用酶消化法分离TIL，由于IV型胶原酶、透明质酸酶价格较贵，消化时间长，故有4例标本采用0.25％Trypsin和0.02％EDTA消化37℃10～20分钟，但从每克瘤组织获得的淋巴细胞看，该组与另两组间有显著性差异。因而我们认为对原发瘤体不宜用Trypsin和EDTA消化。Ⅳ型胶原酶单独消化与并用透明质酸酶无显著性差异，分离出的TIL数量相似。不同消化温度(37℃4小时，4℃20小时)对TIL的收获和活性上均无显著性差异。从38例标本分层前与分层后淋巴细胞回收率分析，各病例之间差异很大，这可能由于癌组织及浸润的淋巴细胞密度个体之间有差异，另外实验操作也可造成误差。我们的平均回收率与文献报道相似，而且鳞癌与腺癌平均回收率无显著性差异，这提示回收率与病理类型关系不大，浸润的淋巴细胞密度并不随着病理类型的不同有较大差异。

　　据不同病理类型计算每克瘤组织获取淋巴细胞数，虽然鳞癌收获TIL10⁷以上的比例要比腺癌多，但经卡方检验，两者之间并无显著性差异，提示每克瘤组织得到的TIL数与病理类型关系不大。从TIL收获数量与分期的关系看，Ⅰ期与Ⅲ、Ⅳ期存在显著性差异，即Ⅰ期每克瘤组织获取TIL数比Ⅲ、Ⅳ期明显多。国内外许多文献早已报道肿瘤浸润的淋巴细胞越多，预后越好^［7、8］。Ⅰ期患者瘤体浸润的淋巴细胞要比Ⅲ、Ⅳ期明显多，这可能与早期患者免疫功能尚好，IL-2分泌及淋巴细胞对IL-2应答较高有关。

　　TIL开始培养后，都要经过活化、分裂增殖的过程，在培养液中可以不同的外观形态存在。本组观察结果显示TIL可长期培养扩增，考虑不生长或逐渐死亡可能与TIL表面IL-2R减少或缺乏有关。

　　用LAK培养上清的34例患者，从其不同时间TIL增殖倍数及其最高增殖倍数出现的时间来看，大部分病例TIL在第7～28天之间增殖最旺盛，以后生长缓慢，甚至数量减少，这与文献报道TIL生长特性大致相符。观察这34例TIL的最高增殖倍数，发现50％(17例)的TIL在10～50倍之间，另有14.7％(5例)在50倍以上，仅1例TIL增殖达2?000倍以上，表明肺癌TIL大部分增殖倍数为十几倍到几十倍，比文献报道黑色素瘤、肾癌大部分增殖倍数达几百倍、上千倍要低^［9、10］。

　　我们对此34例TIL按不同病理类型、不同分期进行比较，并做统计学处理，发现腺癌TIL增殖明显比鳞癌好，有非常显著的差异。两者分离的TIL无明显差异，增殖差异的原因可能是腺癌TIL表面IL-2R、释放IL-2水平及对IL-2应答能力均要比鳞癌高，也可能是腺癌细胞比鳞癌细胞抗原性强，分离前由于癌细胞多，TIL受抑制，而分离后残存的少量癌细胞可作为抗原刺激TIL活化增殖。从目前治疗腺癌的手段来看，除手术外，腺癌对化、放疗均不敏感，且易复发、转移，故可以利用腺癌TIL增殖倍数高的特点，予患者加用TIL治疗，杀灭微小病灶，不失为一种有效的辅助治疗手段。从分期角度来看，Ⅰ期与Ⅲ、Ⅳ期TIL在最高增殖倍数上无显著性差异。可以推测虽然Ⅰ期瘤浸润淋巴细胞数量比Ⅲ、Ⅳ期多，但Ⅲ、Ⅳ期TIL在IL-2R数量、IL-2产生能力及TIL对IL-2应答能力上与Ⅰ期无明显差别，只是由于Ⅲ、Ⅳ期肿瘤产生更多的抑制因子抑制TIL的活化。当把瘤细胞去掉、抑制因子不存在的情况下，TIL又表现出与Ⅰ期相同的增殖能力。由此推测Ⅲ期患者手术后接受TIL治疗比Ⅰ期更有意义。国外Ratto研究小组^［2］报道术后给予TIL治疗，Ⅱ期患者生存期与对照组无显著性差异，Ⅲ期患者生存期比对照组长约14个月，也证实上述推测。

　　综上所述，肺癌患者的TIL可被有效地分离和增殖，并已具备了应用于临床治疗肺癌的条件。

　　参考文献

　　1，Rosenberg SA,Pachard BS,Aebersold DM,et al.Use of tumor-infiltrating lymphocytes and interleukin-2 in the immunotherapy of patients with metastatic melanoma.New Eng J Med,1988,319(25)∶1676-1680.

　　2，Ratto GB,Zino P,Mirabelli S,et al.A randomized trial of adoptive immunotherapy with tumor-infiltrating lymphocytes and interleukin-2 versus standard therapy in the postoperative treatment of resected nonsmall cell lung carcinoma.Cancer,1996,78(2)∶244-251.

　　3，Spiess PJ,Yang JC,Rosenberg SA.In vivo,antitumor activity of tumor-infiltrating lymphocytes expanded in recombinant interleukin-2.J Natl Cancer Inst,1987,79(5)∶1067-1075.

　　4，Aoki Y.Use of adoptive transfer of tumor-infiltrating lymphocytes alone or in combination with cisplatin-containing chemotherapy in patients with epithelial ovarian cancer.Cancer Res,1991,51(7)∶1934-1939.

　　5，Rosenberg SA,Spiess P,Lafreniere R.A new approach to the adoptive immunotherapy of cancer with tumor infiltrating lymphocytes.Science,1986,233(4770)∶1318-1321.

　　6，Whiteside TL,Miescher S,MacDonald HR,et al.Separation of tumor-infiltrating lymphocytes from tumor cells in human solid tumors.A comparison between velocity sedimentation and discontinuous density gradients.Immunol Methods,1986,90(2)∶221-233.

　　7，Lipponen PK,Eskelinen MT,Jauhiainen K,et al.Tumor infiltrating lymphocytes as an independent prognostic factor in transitional cell bladder cancer.Eur J Cancer,1993,29(1)∶69-75.

　　8，陆鸣，黄志英.肺腺癌局部淋巴细胞浸润特点与患者预后相关性的研究.肿瘤，1996,2(增刊)∶249-253.

　　9，Dillman RO,Oldham RK,Barth NM,et al.Continuous interleukin-2 and tumor-infiltrating lymphocytes as treatment of advanced melanoma.Cancer,1991,68(1)∶1-8.

　　10，Belldegrun A,Muul LM,Rosenberg SA.Interleukin-2 expanded tumor-infiltrating lymphocytes in human renal cell cancer:isolation,characterization and antitumor activity.Cancer Res,1988,48(1)∶206-214.

收稿日期：2000-02-18

修回日期：2000-06-01