p14^ARF对照射后肺癌细胞加速再群体化抑制效应

中华放射肿瘤学杂志 2000年第3期第9卷 论　　著

作者：胡义德　高楠　曹晓运　周决　沈瑾　曹世龙

单位：胡义德　高楠　周决　沈瑾　曹世龙　曹晓运（上海医科大学华山医院神经外科）

关键词：蛋白质p14ARF；ARF基因；转染；细胞周期，调控；A549、H460细胞系/放射；加速再群体化

　　【摘要】　目的　探讨抑癌蛋白p14^ARF功能恢复对照射后肺癌细胞加速再群体化的影响。方法　以ARF基因纯合缺失但表达野生型p53的人肺腺癌A549和H460细胞系为靶细胞，应用Fugene6对照射后的细胞进行pCI-neo-p14^ARF表达载体基因转染，检测照射前后和转染前后细胞潜在倍增时间（T_pot）、细胞周期分布及克隆存活率变化。结果　6 gy X射线照射后96 h处，A549和H460细胞T_pot分别缩短25.4％和29.2%，与照射前比较差异有显著性意义（P＜0.01）。此时进行p14^ARF表达载体基因转染，恢复p14^ARF功能，可使A549和H460细胞T_pot延长并接近照射前水平，同时伴随G₀/G₁期和G₂/M期细胞显著增加,S期细胞显著下降,克隆存活率下降。结论　A549和H460细胞照射后存在加速再群体化。p14^ARF功能恢复对其照射后加速再群体化有抑制作用，该作用与p14^ARF的G₁、G₂期阻滞功能密切相关。

Suppressing effect of tumor suppression protein p14^ARF on accelerated repopulation of irradiated human lung carcinoma cells after irradiation

HU Yide, GAO Nan, CAO xiaoyun, et al.

　　(Department of Radiation Oncology, Cancer Hospital, Shanghai Medical University, shanghai 200032, China)

　　【Abstract】　Objective　 to study the suppressing effect of tumor suppression protein p14^ARF in its functional restoration of accelerated repopulation of irradiated human lung carcinoma cells.　Methods　Target cells used in this study were homogenous ARF gene lost but wild type p53 expressed in human lung adenocarcinoma cell lines A549 and H460. The cells were transfected with the human p14^ARF expression vector (pCI-neo-p14^ARF) by the new nonliposomal transfection reagent Fugene 6. Potential doubling time(T_pot), cell cycle distribution and clone survival rate were monitored before and after irradiation and gene transfection. 　Results　T_pot of A549 and H460 cells decreased 25.4％and 29.2% respectively at 96 hours after 6 Gy X-ray irradiation. It was significantly shorter than that of the non-irradiation group（P＜0.01）. when the ARF gene was transfected at this time, the T_pot of A549 and h460 cells increased significantly and were close to the level of the non-irradiated group. The cell proportion of G₀/G₁ and G₂/M phases increased, S phase decreased, and clone survival rate also decreased significantly when the T_pot was prolonged after p14^ARF functional restoration. 　Conclusions　Accelerated repopulation was observed in irradiated human lung adenocarcinoma cell line A549 and H460. It could be suppressed after p14^ARF functional restoration. This might closely be correlated with its G₁ and G₂ blocking effects of p14^ARF.

　　【Key words】

　　抑癌蛋白p14^ARF是细胞周期素依赖性激酶4（CDK4）抑制蛋白（p16^INK4a）可变读框基因（alternative reading frame, ARF）编码的产物，它能提高和稳定细胞p53水平，增强p53在G₁—S期和G₂—M期的限制点效应，最终使细胞阻滞于G₁期和G₂期。因此，p14^ARF具有显著的细胞周期负调控作用^［1］。照射后克隆源性肿瘤细胞的加速再群体化(accelerated repopulation）是基础和临床研究中较为常见的现象^［2,3］。潜在倍增时间（potential doubling time, T_pot）缩短是反映克隆源性肿瘤细胞加速再群体化的可靠指标^［4］。本实验以ARF基因纯合缺失但表达野生型p53的人肺腺癌A549和H460细胞系为研究对象，探讨了它们在照射前后T_pot的变化，并对照射后各时间点的细胞进行p14^ARF表达载体基因转染，观察p14^ARF功能恢复对照射后克隆源性肺癌细胞加速再群体化的影响。

　　1　材料与方法

　　1.1　细胞系及细胞培养：实验选用已存在ARF基因原发纯合缺失但表达野生型p53的人肺腺癌A549和H460细胞系（美国）为靶细胞，在含10％小牛血清的RPMI1640培养基(Gibco)中，37℃、5％CO₂、饱和湿度下培养，均呈贴壁生长。

　　1.2　载体：人p14^ARF真核表达载体pCI-neo-p14^ARF，是将人p14^ARF cDNA编码框399 bp序列构建于真核表达质粒pCI-neo（空载体）而成，载体总长度为6 kB。常规方法扩增、抽提纯化及定量。

　　1.3　分组及照射：在6孔细胞培养板中，每孔接种3×10⁵细胞，加3 mL含10％小牛血清的培养液培养24 h，达到60％饱和密度。给予2、4、6、8 gy的X射线一次性照射，照射后第1、2、3、4、5 d采样分析各相关指标。照射采用180 kV X射线，空气中、室温下照射，源皮距40 cm，照射面积为10 cm×15 cm，剂量率为162 cGy/min。

　　1.4　T_pot测定：按2×10⁵细胞/孔,将细胞接种于6孔培养板中培养，分别于第24、48、72、96、120 h取出，用台盼兰染色行活细胞和死细胞计数。按文献［5］中Patterson方法计算细胞在对数增殖期的群体倍增时间（Td），计算公式如下：Td(hr)=(T^．lg2)/(lgN/N₀)，其中T代表对数增殖期时间（h），N₀和N分别代表对数增殖期起始和终止时间点的活细胞数。用Nias^［6］方法计算T_pot公式为：T_pot＝Td^．（1－Φ），其中细胞丢失因子Φ＝1－活细胞比率，活细胞比率＝活细胞数/（活细胞数＋死细胞数）。

　　1.5　克隆存活率测定：将各组细胞接种于6孔培养板中培养21 d,姬姆萨染色，倒置显微镜下计数≥50个细胞的克隆个数，计算克隆存活率(%)。

　　1.6　细胞周期测定:细胞用体积份数为0.80乙醇快速固定，4℃过夜，PBS漂洗2次，细胞裂解液（0.2 mol/L Na₂HPO₄，0.1 mol/L Citric acid，0.1% Triton X-100，pH7.8）裂解30 min，RNA酶（50 mg/L）37℃消化10 min，加碘化丙啶（PI，10 mg/L）染色后行流式细胞仪测定。

　　1.7　基因转染：（1） 细胞准备：在6孔细胞培养板中，每孔接种3×10⁵细胞，加3 mL含10％小牛血清的培养液培养24 h，达到60％饱和密度。给予6 gy的X射线一次性照射，照射后第1、2、3、4、5 d进行基因转染。（2）转染液准备：取100μL无血清RPMI 1640培养基置于无菌Eppendorf管中，每管加入6 μL fugene 6（罗氏－宝灵曼公司产品），轻轻吹打混匀，室温静置5 min。在新的Eppendorf管中，分别加入无DNA对照和1 μg载体DNA，TE液（10 mmol/L Tris^．CI, 1 mmol/L EDTA, pH8.0）稀释，使总体积均为10μL。将以上两液混合混匀，室温静置15 min。（3）细胞转染：将转染液滴加入6孔细胞培养板中，混匀，继续培养。（4）G418抗性克隆的筛选：经转染的细胞培养48 h后换培养液，加入G418（罗氏－宝灵曼公司产品），使其终浓度为400 mg/L；常规培养，每3 d换培养液并加药1次，共筛选21 d，倒置显微镜下计数抗G418细胞克隆个数。（5）照射后基因转染对T_pot的影响测定：以6 gy X射线一次性照射后96 h处进行基因转染，设假转染对照，转染后48 h取细胞行T_pot检测。

　　1.8　免疫组织化学检测：将培养细胞制成悬液涂片，丙酮固定10 min，TBS漂洗2次；1∶200稀释羊抗人p14^ARF多克隆抗体（Santa cruz，USA）孵育6 h，1∶200驴抗羊IgG二抗孵育30 min，ABC试剂盒显色，显微镜下观察。

　　1.9　统计学方法：采用t检验。数据均为3次或3次以上重复实验的均值，表示为±s。

　　2　结果

　　2.1　不同照射剂量引起肺癌细胞T_pot变化：照射后96 hT_pot检测结果显示，随着照射剂量的递增，A549和H460细胞的T_pot逐渐缩短，在6 gy时，T_pot分别缩短25.4％和29.2%，与照射前（0 Gy）比较差异有显著性意义（P＜0.01），见图1。

图1　不同剂量照射后96 h引起A549和H460细胞T_pot变化

　　2.2　照射后不同时间肺癌细胞T_pot变化：以6 gy剂量X射线照射后不同时间T_pot检测结果显示，在照射后48 h以内的A549和H460细胞T_pot缩短，但与照射前比较，差异无显著性意义（P＞0.05）；72 h处T_pot进一步缩短，与照射前比较，差异有显著性意义（P＜0.05）；96 h以后，T_pot明显缩短，与照射前比较，差异有极显著性意义（P＜0.01），见图2。

图2　6 Gy X射线照射后不同时间A549和H460细胞T_pot变化

　　2.3　照射后不同时间ARF基因转染的效率及p14^ARF表达变化：以6 gy剂量X射线照射后不同时间进行ARF基因转染结果显示，在照射后48 h以内进行基因转染，A549和H460细胞的抗G418克隆存活率低于3%，72 h时为10%～15%，而在96 h以后达40%，与72 h以内各组比较，增加非常显著（P＜0.01）。免疫组织化学结果显示，照射前后A549和H460细胞p14^ARF表达均为阴性，照射后96 h转染ARF基因G418筛选抗性克隆细胞p14^ARF表达均为阳性。

　　2.4　照射后ARF基因转染引起肺癌细胞T_pot变化:以6 gy剂量X射线照射后96 h进行ARF基因转染，同时以转染空载体pCI-neo为对照。转染后48 h进行T_pot检测结果显示，ARF基因转染组A549和H460细胞T_pot明显延长，与照射前比较，差异无显著性意义（P＞0.05）；而空载体组和照射后未转染组T_pot仍缩短，与照射前和照射后ARF基因转染组比较，差异有显著性意义（P＜0.01），见图3。

图3　照射后ARF基因转染引起A549和H460细胞T_pot变化

　　2.5　T_pot、细胞周期分布与克隆存活率之间的相互变化:以6 gy剂量X射线照射后96 h进行ARF基因转染，转染后48 h进行T_pot、细胞周期分布及克隆存活率检测结果显示，照射后未转染和空载体转染A549和H460细胞T_pot均缩短，与照射前比较，G₀/G₁期细胞比例减少，S和G₂/M期细胞比例增加,克隆存活率下降（P＜0.01）；照射后ARF基因转染A549和H460细胞T_pot均延长并接近照射前水平,与照射后未转染和空载体转染A549和H460细胞比较，G₀/G₁期细胞比例回升，G₂/M期细胞比例进一步增加，而S期细胞比例显著减少,克隆存活率下降（P＜0.05）。详见表1。

　　3　讨论

　　1969年， Hermens等^［7］通过体内外实验首次证实，成横纹肌细胞肉瘤受放射后4d左右，其克隆源性肿瘤细胞出现加速再群体化现象。1977年，Steel首先提出T_pot概念，即在没有细胞丢失的情况下，肿瘤细胞数量增加一倍所需要的时间，它主要反映存活肿瘤克隆源性细胞的有效倍增时间。因此，T_pot缩短是反映克隆源性肿瘤细胞加速再群体化的可靠指标。近年来，已在鼻咽癌、喉癌、乳腺癌、宫颈癌、胰腺癌等肿瘤的基础与临床研究中发现，照射后存在克隆源性肿瘤细胞加速再群体化^［2,3,8］。本实验结果显示，人肺腺癌A549和H460细胞在一次性照射后T_pot均缩短，在6 gy以内与照射剂量呈正比，在照射后96 h以内，与照射后时间呈正比。它表明肺癌细胞在照射治疗过程中也出现了加速再群体化，且其加速再群体化速率在一定范围内与照射剂量和照射后时间显著正相关。Sham等^［4］在研究中国仓鼠肺癌细胞系V79时也有类似发现。Willers^［9］研究结果表明加速再群体化在肺癌放射治疗中也很常见。

表1　A549和H460细胞T_pot、细胞周期分布与克隆存活率之间的相互变化（±s，n=3）

　　放射治疗是肿瘤综合治疗的重要手段之一，决定放射治疗疗效的核心是肿瘤放射敏感性。已有研究证实，放射治疗后克隆源性肿瘤细胞的加速再群体化可降低肿瘤的局部控制率^［10］。因此，照射后克隆源性肿瘤细胞的加速再群体化已成为提高临床肿瘤放射治疗疗效的严重障碍之一。加速超分割放射治疗为解决这一问题作出了一定的贡献，但有时收效甚微，提示进一步寻找克服肿瘤放射治疗后加速再群体化的有效途径已显得尤为重要。加速再群体化的显著特点是细胞周期分布和细胞周期时间的变化。因此，从理论上讲，要克服加速再群体化问题的理想途径应从细胞周期的角度去考虑。INK4a是1993年发现的第1个直接调控细胞周期并抑制细胞分裂的新型抑癌基因，它定位于人第9号染色体短臂2区1带（9p21），由3个外显子（E1α，E2，E3）和2个内含子组成，3个外显子共同编码CDK4抑制蛋白即p16^INK4a，该蛋白与细胞周期素D（cyclin d）竞争性结合CDK4，抑制CDK4的催化活性，从而抑制Rb蛋白磷酸化，减少延伸因子E2F释放，使细胞分裂不能通过G₁—S期限制点而被阻滞于G₁期。1995年又发现INK4a存在可变读框基因ARF，它与INK4a共享E2和E3，取代E1α的是位于其上游约20 kB处的E1β，3个外显子共同编码蛋白为p14^ARF，该蛋白主要与癌蛋白MDM2结合，加速MDM2降解，恢复和稳定细胞p53水平，增强p53在G₁—S期和G₂—M期的限制点效应，最终使细胞阻滞于G₁期和G₂期。可见,p14^ARF具有显著的细胞周期负调控作用^［1］。因此，INK4a或ARF基因有可能成为调控癌细胞周期的理想候选基因。

　　本实验以ARF基因纯合缺失但表达野生型p53的人肺腺癌A549和H460细胞系为研究对象，首先检测了照射后进行基因转染的可行性和最佳转染时机；结果发现照射后96 h时转染效率达到峰值且转染细胞有目的基因产物表达，表明照射后96 h时进行基因转染是可行的。由于细胞的增殖活力是决定外源基因转染成功率的重要因素，这从另一个侧面证实了A549和H460细胞照射后加速再群体化的存在。进一步观察p14^ARF功能恢复对照射后克隆源性肺癌细胞加速再群体化的影响，结果发现p14^ARF功能恢复可使A549和H460细胞T_pot显著延长并接近照射前水平，而且可降低照射后克隆存活率。它表明p14^ARF功能恢复可抑制照射后A549和H460细胞的加速再群体化，增加放射敏感性。细胞周期分析结果提示，p14^ARF功能恢复对加速再群体化的抑制与其G₁、G₂期的阻滞效应密切相关。基金项目：上海市科技发展基金资助项目（974119037)

　　通信作者：胡义德，400037重庆，中国人民解放军第三军医大学新桥医院呼吸研究所

　　参考文献

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　　4，Sham E, Durand RE. Cell kinetics and repopulation mechanisms during multifraction of spheroids. Radiother Oncol,1998,46:201-207.

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　　6， Nias AHW. Clinical radiotherapy. 2nd ed. New York:Churchill Livingstone,1988.36.

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(收稿日期：1999-12-27)