Northern印迹杂交分析nm23基因在人肺癌中的表达研究
中华肿瘤杂志 1998年第5期第0卷 基础研究
作者：刘伦旭 覃扬 周清华 石应康 孙芝琳 孙泽芳
单位：610041 成都，华西医科大学附属第一医院胸心外科(刘伦旭、周清华、石应康)，基础医学院生化教研室(覃扬、孙芝琳、孙泽芳)
关键词： 肺肿瘤 nm23基因 基因表达 印迹法，RNA
【摘要】 目的 探讨nm23基因表达在人肺癌中的作用。方法 通过Northern印迹杂交，检测40例人肺癌组织和19例非癌肺组织的nm23-H1和nm23-H2 mRNA表达，采用地高辛标记和检测系统显示杂交信号，并分析mRNA表达与肺癌临床特征的关系。结果 低分化鳞癌的nm23-H2 mRNA表达较中高分化鳞癌显著降低(P＜0.01)，小细胞肺癌的nm23-H1和nm23-H2 mRNA表达较肺鳞癌明显降低。但在有或无淋巴结转移的原发癌灶组织间，以及肺癌的临床分期间，nm23基因mRNA表达差异无显著性(P＞0.05)。结论 nm23基因mRNA表达与肺癌的组织分化有关，未发现其在肺癌中的癌转移抑制作用。
northern blot analysis of nm23 gene expression in human lung cancer Liu lunxu, Qin Yang, Zhou Qinghua, et al. Department of Thoracocardiac Surgery, The first University Hospital, West China University of Medical Sciences, Chengdu610041
【Abstract】 Objective To investigate the role of nm23 gene expression in lung cancer. Methods Forty human lung cancer tissues and 19 non-cancerous pulmonary tissues were studied for their nm23-H1 and nm23-H2 mRNA expression with nonradioactive Northern blot hybridization. Correlation of nm23 mRNA expression with clinical features of lung cancer was analyzed. Results The mRNA expression of nm23-H2 gene in poorly differentiated squamous-cell carcinoma was significantly decreased compared to that in moderately differentiated squamous-cell carcinoma. The mRNA expression of nm23-H1 and nm23-H2 genes in small cell lung cancer was decreased compared to that in squamous-cell carcinoma. No significant difference in nm23 mRNA expression was observed in lung cancers with and without lymph node metastasis, nor was there significant difference in patients with lung cancers in different stages. Conclusion The mRNA expression of nm23 gene is correlated with the degree of differentiation of lung cancer, but there is no evidence of metastasis suppression effect by nm23 gene.
【Subject words】 Lung neoplasms nm23 gene Gene expression Blotting, northern, RNA
nm23基因于1988年由美国国立癌症研究所的Steeg等［1］发现。目前在人类已发现两种nm23基因：nm23-H1和nm23-H2［2］，均定位于人染色体17q21.3，其蛋白质产物为核苷二磷酸激酶(NDPK)［3］。早期研究显示其对癌细胞株的运动能力和转移潜能有抑制作用，被认为是一种癌转移抑制基因。在人乳腺癌、肝癌、胃癌、恶性黑色素瘤、卵巢癌等肿瘤中，nm23基因表达降低与肿瘤转移特性相关。但随着研究的扩展，在神经母细胞瘤、甲状腺癌及前列腺癌中，研究显示其并无抑制肿瘤转移的作用，而是与肿瘤增殖及浸润有关［4］。为探讨nm23基因在肺癌发生、发展过程中的作用，本研究在RNA水平，采用Northern印迹杂交，检测了肺癌组织中nm23-H1和nm23-H2基因mRNA表达状态，并分析其与肺癌临床特征的关系。
材料与方法
1.组织标本：40例原发肺癌组织和19例远离癌灶的非癌肺组织来源于本院胸心外科手术患者。40例原发肺癌中有淋巴结转移22例，无淋巴结转移18例。其中小细胞肺癌4例(Ⅰ～Ⅱ期2例，Ⅲ～Ⅳ期2例)，鳞癌18例(低分化10例，中高分化8例；Ⅰ～Ⅱ期7例，Ⅲ～Ⅳ期11例)，腺癌18例(低分化5例，中高分化13例；Ⅰ～Ⅱ期3例，Ⅲ～Ⅳ期15例)。采用国际抗癌联盟1986年修订的分期标准。
2.探针的制备：人类P nm23-H1和P nm23-H2 cDNA重组质粒由Patricia s Steeg博士赠送，Pr-actin重组质粒由本校孙芝琳教授提供。P nm23-H1、P nm23-H2和Pr-actin分别经BamH1、EcoRI和HindIII/PstI酶切，可分别获得900bp、700bp和900bp的cDNA插入片段。玻璃乳DNA分离法回收插入片段。参考试剂盒(Boehringer mannheim产品)提供的方案，采用随机引物法，以非放射性地高辛标记回收插入片段制成探针。
3.Northern印迹杂交：采用硫氰酸胍-酚-氯仿一步法提取肺组织总RNA。取25μg总RNA用1%琼脂糖-甲醛凝胶电泳分离，采用虹吸印迹法将RNA转移至尼龙膜(Bio-Rad产品)上。杂交液为7%SDS，50%甲酰胺，5×SSC，2%封闭剂，50 mmol/L磷酸钠pH7.0，0.1%十二烷基肌氨酸钠。探针浓度为30 ng/ml。按试剂盒(Boehringer mannheim产品)提供的方法进行杂交及化学萤光显像。本实验每张膜分别先后与nm23-H1、nm23-H2、r-actin探针杂交。
4.表达强度检测：使用美国UVP GDS-8000型分析系统对杂交影像进行扫描分析，测定每个杂交信号的强度。因r-actin基因在各种组织中表达稳定，故以其作为内参照，消除上样量的差别。nm23基因相对表达强度具体计算公式如下：
某样品nm23相对表达强度=某样品nm23扫描值×(所有样品actin扫描均值)/(某样品actin扫描值)
5.统计学处理：本研究资料为计量资料，如数据服从方差齐性及呈正态分布，使用t检验；如方差不齐或呈非正态分布，则采用组间计量资料的秩和检验(Wilcoxon检验)。以P＜0.05为差异有显著性标准。
结果
1.nm23-H1和nm23-H2 mRNA在人肺癌中的表达：与相应cDNA探针杂交显示nm23-H1和nm23-H2基因mRNA均位于0.8kb位置处(附图，未显示分子量参照物)，与文献报道相符。未发现两基因的mRNA异常转录本或纯合缺失。扫描检测结果显示，在肺癌组织和非癌肺组织间，nm23-H1和nm23-H2基因mRNA表达差异均无显著性(P＞0.05,表1)。
2.nm23基因mRNA表达与肺癌临床特征的关系：按肿瘤临床特征对肺癌进行分类，分析它们与nm23基因表达之间的关系。结果显示，在肺鳞癌的
1，3，5：原发肺癌组织； 2，4：非癌肺组织
附图 Northern印迹杂交检测nm23基因mRNA在人肺癌中的表达
表1 nm23基因mRNA在肺癌和非癌肺组织中相对表达强度
| 组织类型 |
例数 |
nm23-H1 |
nm23-H2 |
 ±s |
P值 |
±s |
P值 |
| 肺癌组织 |
40 |
42.21±11.71 |
|
35.01±13.11 |
| |
|
|
＞0.05 |
|
＞0.05 |
| 非癌肺组织 |
19 |
44.78±14.16 |
|
35.89±14.23 |
组织分化中，低分化鳞癌的nm23-H2基因表达较中高分化鳞癌显著降低(P＜0.01)；小细胞肺癌的nm23-H1和nm23-H2基因mRNA表达较肺鳞癌也有明显降低；但在肺癌的临床分期间，有或无淋巴结转移的肺癌间，两基因表达差异无显著性(P＞0.05，表2)。
讨论
自从nm23基因被发现以来，陆续有了较多研究。在几种单纯的肿瘤细胞系的研究中，nm23基因对肿瘤细胞转移潜能的抑制作用较明确［5］，而在各种临床肿瘤的广泛研究中，结果差异较大，支持和不支持其转移抑制特性的观点并存。
本研究通过Northern印迹杂交分析了40例原发肺癌组织的nm23-H1和nm23-H2基因mRNA表达，发现在肺鳞癌中，低分化癌较中高分化癌的nm23-H2表达显著降低(P＜0.01)，此外，小细胞肺癌的nm23-H1和nm23-H2基因mRNA表达较肺鳞癌也有明显降低。此结果提示nm23基因表达与肺癌的组织分化有关。但实验所收集的小细胞肺癌例数较少，其结果仅为一种提示，尚需扩大样本量进一步证实。实验还显示了nm23基因mRNA表达在肺癌的临床分期间，以及肺癌有或无淋巴结转移间差异无显著性(P＞0.05)，表明在本实验研究的肺癌组织中，nm23基因mRNA表达与肺癌转移无明显关系，尚不能支持nm23基因在肺癌中有抑制癌转移
表2 nm23基因mRNA表达与肺癌临床特征的关系
| 肺癌临床特征 |
例数 |
nm23-H1 |
nm23-H2 |
| ±s |
P值 |
±s |
P值 |
| 肺癌 |
| ①未分化 |
4 |
31.20±14.52 |
|
23.82±7.61 |
| ②低分化 |
15 |
44.92±11.85 |
＞0.05* |
35.60±10.98 |
＞0.05* |
| ③中高分化 |
21 |
42.36±10.37 |
|
36.73±14.61 |
| Ⅰ～Ⅱ期 |
12 |
43.07±12.85 |
＞0.05 |
32.06±11.17 |
＞0.05 |
| Ⅲ～Ⅳ期 |
28 |
41.84±11.41 |
|
36.28±13.84 |
| ①小细胞癌 |
4 |
31.20±14.52 |
＜0.05** |
23.82±7.61 |
＜0.05** |
| ②鳞癌 |
18 |
46.09±9.79 |
＞0.05△ |
40.37±11.47 |
＞0.05△ |
| ③腺癌 |
18 |
40.77±11.61 |
＞0.05△ |
32.15±13.11 |
＞0.05△ |
| 有淋巴结转移 |
22 |
41.01±11.65 |
＞0.05 |
34.46±15.36 |
＞0.05 |
| 无淋巴结转移 |
18 |
43.67±11.94 |
|
35.69±10.07 |
| 肺鳞癌 |
| 低分化 |
10 |
46.40±10.45 |
＞0.05 |
35.61±11.13 |
＜0.01 |
| 中-高分化 |
8 |
45.48±9.21 |
|
49.88±7.17 |
注：①、②、③为组间比较的编号 *各组间两两比较 **①与②组间比较 △①与③，②与③组间比较
的作用。我国雷文东等［6］用免疫组化方法检测了88例人肺癌nm23基因的蛋白产物NDPK的表达，发现NDPK/nm23表达与肺鳞癌淋巴结转移有关，与肺腺癌有无淋巴结转移无关。此结果与本研究结果有部分差异，可能系由于本研究反映的是nm23基因不同的表达层次以及将nm23基因的两种亚型进行分别分析的原因。
因nm23基因并非在所有类型肿瘤中都表现为癌转移抑制功能，有人提出其作用具有组织差异性［7］，出现这种差异性的机制目前仍不清楚。Steeg等［8］认为，根据NDPK/nm23的状态，以及所涉及到的不同信号传递途径，其可能显示出不同的功能。Okada等［9］研究了nm23-H1和nm23-H2两基因的转录起动部位，发现二者具有与转录因子相结合的位点，但二者的结合位点并不相同，说明nm23-H1和nm23-H2是通过不同的方式被调控，具有相互独立性，这些调控方式可能具有细胞类型差异性。目前对nm23基因的作用机制，特别是发挥作用的具体生化途径认识不够，尚需进行更深入的研究。
参考文献
1Steeg PS, Bevilacqua G, Kopper L, et al. Evidence for a novel gene associated with low tumor metastatic potential. J Natl Cancer Inst,1988, 80:200-204.
2Stahl JA, Leone A, Rosengard AM, et al. Identification of a second human nm23 gene, nm23-H2. Cancer Res, 1991, 51: 445-449.
3Gilles AM, Presecan E, Vonica A, et al. Nucleoside diphosphate kinase from human erythrocytes. J Biol Chem, 1991, 266: 8784-8789.
4刘伦旭，石应康，周清华. 癌转移抑制基因：nm23的研究进展.中国胸心血管外科临床杂志，1995，2：48-51.
5Leone A, Flatow U, King CR, et al. Reduced tumor incidence, metastatic potential, and cytokine responsiveness of nm23-transfected melanoma cells. Cell,1991, 65: 25-35.
6雷文东，张汝刚，闫水忠，等.nm23基因在人肺癌中的表达及其与肺癌淋巴结转移的关系.中华肿瘤杂志，1994，16：277-279.
7Haut M, Steeg PS, Willson JK, et al. Induction of nm23 gene expression in human colonic neoplasms and equal expression in colon tumors of high and low metastatic potential. J Natl Cancer Inst, 1991, 83: 712-716.
8Liotta LA, Steeg PS. Clues to the function of nm23 and Awd proteins in development, signal transduction and tumor metastasis provided by studies of dictyostelium discoideum. J Natl Cancer Inst, 1990, 82: 1170-1172.
9Okada K, Urano T, Baba H, et al. Independent and differential expression of two isotypes of human nm23: analysis of the promoter regions of the nm23-H1 and H2 genes. Oncogene, 1996, 13: 1937-1943.
本课题受国家自然科学基金、卫生部优秀青年科技人才专项基金、美国纽约中华医学基金资助
(收稿：1997-12-16 修回：1998-03-02)
用户登录 
新用户注册