肺癌患者血中癌细胞角蛋白20的检测

中华医学检验杂志 2000年第1期第23卷 论著

作者：冯久贤　包国良　沙慧芳　董强刚

单位：冯久贤（200030 上海市胸科医院上海市胸部肿瘤研究所）；包国良（200030 上海市胸科医院上海市胸部肿瘤研究所）；沙慧芳（200030 上海市胸科医院上海市胸部肿瘤研究所）；董强刚（200030 上海市胸科医院上海市胸部肿瘤研究所）

　　关键词： 肺肿瘤；角蛋白；肿瘤标记；生物学

　　 【摘要】目的　以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测外周血肺癌细胞，以监测其血路转移情况。方法　应用RT-PCR方法检测25例肺癌手术患者和35例肺癌化疗前患者外周血中细胞角蛋白20(CK20)，并以肺癌组织和非肿瘤患者外周血为对照。结果　非肿瘤患者外周血中基本上无CK20检出，肺癌手术时肺动脉血中CK20检出明显升高，阳性率达54%（13/25）。晚期肺癌患者CK20表达亦较高，阳性率达40%（10/25）。结论　CK20可能作为肿瘤标志物，检测外周血中的肺癌细胞及用于预测肿瘤转移复发。

Detection of cytokeretin 20 in peripheral blood of patients with lung cancer

FENG Jiuxian，BAO Guoliang，SHA Huifang, et al.

　　（Shanghai Institute of Thoracic Tumors， Shanghai Chest Hospital, Shanhai 200030, China）

　　 【Abstract】Objective　To detect peripheral cancer cells by reverse transcriptase-polymerase chain reaction （RT-PCR）for monitoring metastasis in blood. Methods　Twenty-five patients with lung cancer receiving operation and 35 patients having pre-chemotherapy were determined by RT-PCR cytokeretin 20 （CK20） of cancer cells in the peripheral blood in contrast to that of the tissue of lung cancer and the peripheral blood of patients with non-tumor. Results　In the operative group, 13 patients (54%) showed positive CK20 in artery blood and 10 (40%) positive CK20. In the peripheral blood of patients with nontumor, CK20 was negative. CK8 and CK19 were rarely positive. Conclusion　CK20 may be a tumor marker for detecting cancer cells in peripheral blood as well as tumor metastasis and relapse.

　　 【Key words】Lung neoplasms;Keretin;Tumor markers

　　血循环中的肺癌细胞是导致肿瘤转移和复发的重要原因。及时检测外周血中肺癌细胞，不仅对判断其转移复发有重要参考价值，且有助于肺癌的临床治疗^［1，2］。我们用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测外周血中肺癌细胞的细胞角蛋白20(Cytokeratin 20, CK20)，并研究其与临床转归的关系，报告如下。

　　材料和方法

　　一、材料

　　1.样本来源：胸外科肺癌患者25例，于术前取外周血、术中取肺动脉血；肺内科肿瘤患者35例取外周血。对照组：(1)肺癌标本20例，正常肺组织10例，均取自本院手术患者，标本置于-70℃贮存。(2)非肿瘤患者取自本院心内科心肌炎患者外周血40例和肺部良性疾患10例(气胸3例，肺炎3例，胸水2例，结核2例)。外周血用氯化铵去除红细胞，取细胞层置-30℃。

　　2.试剂与仪器：RT-PCR RNA一步样品处理试剂盒为华美生物工程公司产品；逆转录试剂盒、Taq酶、dNTP、蛋白酶K和PCR扩增仪(TC-1)均购自美国；冷冻离心机(2360K)为德国产品。

　　二、方法

　　1.引物合成：CK20引物序列为Primer 1：P1 GCGTTTATGGGGGTGCTGGAG，P2 GGCTCTGGGAGGT-GCGTCTC，P3 CGGGGGGGACCTGTTTGT，P4 CAGTG-TTGCCCAGATGCTTGTG；CK8：P1 AACAACCTTAGG-CGGCAGCT，P2 GCCTGAGGAAGTTGATTCG；CK18：P1 GCGGGACAAGATTCTTGGTG，P2 CTTCAGGCCTTCGA-TCAT；β-actin：P1 ATCATGTTTGAGACCA，P2 CATCT-CTTGCTCGAAGTCCA^［3］。浓度为25 nmol/L。

　　2.样本处理：取手术标本30 mg用蛋白酶K，十二烷基磺酸钠在50℃水浴中消化2 h后和外周血细胞层一样用RNA一步样品处理试剂盒分离模板RNA，再用逆转录试剂盒制备10 μl cDNA，反应条件为42℃1 h，94℃5 min。

　　3.应用巢式PCR扩增CK20：见参考文献［3］。其中第1次PCR扩增，退火温度为65℃；第2次PCR扩增，退火温度为63℃；PCR扩增产物检测，取扩增产物10 μl行2%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，CK20为485 bp，β-actin为318 bp。用数码凝胶图像分析仪进行观察并照像。

　　结果

　　一、CK20在肺癌组织和非肿瘤患者外周血中RT-PCR扩增

　　以肺癌组织的cDNA为模板特异性扩增485 bp基因片段为CK20阳性表达，为了校正组织或外周血取样的不均一性及加样量的误差，在PCR扩增中以多数细胞中均有表达及较为稳定的β-actin基因(318 bp)为内对照来校正CK20的表达量。扩增结果表明，肺癌组织有16例为阳性，正常肺组织有6例阳性，心肌炎患者外周血中均无扩增条带，肺部良性疾患中有1例非特异性肺炎CK20阳性。CK8、CK18在非肿瘤患者外周血中均有阳性检出。

　　二、肺癌患者肺动脉及外周血中CK20的表达

　　1.25例肺癌手术中肺动脉血标本中CK20阳性13例，占52%。术前外周血中有6例阳性，占24%。其中1例术前诊断肺癌，术后病理诊断为错构瘤，其术中肺动脉血CK20为阳性(图1)。

第1～3、5份肺动脉血标本为阳性(CK20 485 bp)；M：PCR分子量

1　肺动脉血标本RT-PCR第2次反应结果

　　2.在35例肺癌患者外周血标本中CK20阳性有12例，占34%。其中Ⅰ-Ⅱ期患者10例中2例阳性(均为T2NOMO)。Ⅲ-Ⅳ期患者25例中10例阳性(均有多处淋巴结转移，其中2例肝转移)，占40%。其中1例1个月后复测CK20仍为阳性。

　　讨论

　　CK是分布于上皮细胞的中间纤维丝，它包括至少20个成员。CK20的分子量为46 000，是一独立的Ⅰ型细胞角蛋白。CK20编码DNA总长18 kb，含有8个外显子、7个内含子，CK20的mRNA长1.75 kb，其表达不受相应编码蛋白质表达高低的影响。引物的设计跨越2个不同的外显子，避免整个基因组的扩增，有利于消除假阳性。我们参照文献设计的PCR反应条件未能得到清晰的扩增条带，后又根据引物合成的参数调节PCR反应条件，得到较好的效果。CK20通常与单层上皮细胞角蛋白共同表达，并以CK8，CK18，CK19最常见，但是CK20有更为严格的上皮特异性分布。本文结果提示：CK20在正常血液中不表达，一但表达CK20的肿瘤细胞进入外周血就可被检测，而CK8，CK18在正常外周血中可有少量阳性，故不宜作为肺癌细胞标志物。

　　本组肺癌患者外周血中检测到肺癌细胞的阳性率为34%，其中多见于晚期患者，这和Soeth等^［3］报告CK20 mRNA表达的阳性率与结肠癌分期(国际癌症防治联合会)有关相符。在肺癌手术中，由于肿瘤受到挤压有较多的癌细胞进入肺动脉中，因此CK20阳性率较高。应用RT-PCR检测外周血中肺癌细胞阳性率可受到下列因素影响：首先是不了解肿瘤细胞释放入血的规律以及在循环中的运行和成活情况，因此易导致样本误差，抽不到含有肿瘤细胞的血液；其次是肿瘤细胞的异质性导致血液循环中存在的肿瘤细胞不表达所要检测的基因；最后还可发生假阳性，原因是CK20为上皮细胞组织特异性抗原的靶基因。在胸部良性上皮性肿瘤手术时，由于手术操作影响，可使上皮细胞进入血中而出现CK20阳性细胞。在肺部疾患中由于炎症影响也可使肺泡上皮进入血液，从而出现CK20阳性细胞，因此必要时可以复测CK20，进行动态观察^［4］。

参考文献

　　1　Burchill SA, Bradbury MF, Pittman K, et al. Detection of epithelial cancer cells in peripheral blood by reverse transcriptase-polymerase chain reaction. Br J Cancer, 1995, 71: 278-281.

　　2　Ghossein RA, Rosai J. Polymerase chain reaction in the detection of micrometastases and circulating tumor cells. Cancer, 1996, 78: 10-16.

　　3　Soeth E, Roeder C, Juhl H, et al. The detection of disseminated tumor cells in bone marrow from colorectal cancer patients by cytokereatin 20 specific nested reverse transciptase polymerase chain reaction is related to the stage of disease. Int J Cancer, 1996, 69: 278-282.

　　4　Peck K, Sher YP, Shih JY, et al. Detection and quantitation of circulating cancer cells in the peripheral blood of lung cancer patients Cancer Res, 1998, 58: 2761-2765.

收稿日期：1999-08-20