P₁₆在非小细胞肺癌中的表达及其与细胞增殖的关系

黑龙江医药科学 2000年第3期第23卷 临床研究

作者：王海英　孙丽丹　史旭红

单位：王海英（佳木斯大学医学院一附院）；孙丽丹（大连市友谊医院）；史旭红（佳木斯市中心医院）

关键词：非小细胞肺癌；NTS1/P16；PCNA；免疫组织化学

　　提要 目的：探讨抑癌基因P₁₆的基因产物在非小细胞肺癌(NSCLC)中的表达情况及其与细胞增殖的关系。方法：采用免疫组化S-P法，检测68例NSCLC患者的手术切除标本中P₁₆的表达情况，并检测PCNA，计算细胞增殖指数(PI, proliferation index)。结果：在68例NSCLC患者标本中，P₁₆的阳性率分别为64.7%，在不同组织类型的NSCLC中的表达无显著性差异(P＞0.05)；其表达随PI分级的升高而下降。结论1、P₁₆参与NSCLC的细胞增殖周期演进，其不同表达水平直接影响NSCLC的细胞分化与增殖，P₁₆蛋白的缺失可能是NSCLC由低度恶性向高度恶性过渡的重要事件；2、P₁₆蛋白表达与NSCLC病理类型无关。

　　多年以来，人们一直致力于肺癌的发病机制的探讨。肺癌细胞癌基因、抑癌基因的发现，使人们对肺癌的认识深入到了分子水平。抑癌基因的改变在肿瘤的发生发展过程中起着重要的作用。P₁₆是一个新型肿瘤抑制基因，在细胞周期的G₁/S期处通过抑制Rb蛋白的活性而抑制细胞增殖，发挥其抑癌功能。本实验采用免疫组织化学S-P法，检测NSCLC患者原发肿瘤切除标本中P₁₆的表达情况，并以PCNA作为细胞增殖程度的判定指标，计算细胞增殖指数(PI, proliferation index)，探讨P₁₆与细胞增殖的关系。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　68例NSCLC患者手术切除、石腊包埋标本取自佳木斯大学第一附属医院病理科1974～1984年存档蜡块。全部标本经10%福尔马林固定，石蜡包埋。常规病理学检查证实，按WHO标准分类，其中鳞癌32例，腺癌31例，未分化大细胞癌5例。

　　1.2 方法

　　采用链酶亲和素－生物素化过氧化物酶复合物(S-P)免疫组化法，抗P₁₆多克隆抗体(C-20)、PCNA(PC-10)单克隆抗体为美国Stanta Cruz生物技术公司产品。S-P试剂盒(即用型)及抗原稀释液购自北京中山生物技术有限公司。工作液的配制：P₁₆、PCNA均按1:50比例用抗原稀释液稀释：以PBS代替一抗作为阴性对照，以已知阳性标切片作为阳性对照。

　　1.3 结果判定

　　染色阳性信号呈棕黄色，每张切片观测10个高倍视野(40×10)内肿瘤细胞的P₁₆蛋白表达，无阳性细胞为阴性(-)：阳性细胞＜肿瘤细胞的50%为阳性(+)；阳性细胞＞肿瘤细胞的50%为强阳性(+、++)。每张切片计数肿瘤实质区细胞200个，细胞增殖指数PI=PCNA阳性细胞数/细胞总数×100%，PI分级：PI=0～25%为Ⅰ级，PI=26%～50%为Ⅱ级，PI=51%～75%为Ⅲ级，PI=75%～100%为Ⅳ级。统计分析采用卡方检验及计数资料相关性分析。

　　2 结果

　　2.1 P₁₆蛋白免疫阳性反应

　　在胞核、胞膜、胞浆均有表达，但以胞核为主。

　　2.2 P₁₆与肺癌病理分型的关系

　　见表1。68例NSCLC组织中，P₁₆免疫反应产物阳性表达44例，总阳性率为64.7%。经r×c列表c ²检验，P₁₆在不同病理分型的肺癌组织中的表达其差异无显著性，(c ²=3.037 P＞0.05)。

表1 P₁₆在NSCLC的表达

　　2.3 P₁₆与细胞增殖的关系

　　见表1。不同PI分级中P₁₆蛋白的不同表达，经Ridit检验(P＜0.05)。得出结论：P₁₆在不同PI分级中的表达强度不同。其中，P₁₆强阳性(++)组R值最小(R=0.253)，阳性组次之(R=0.594)，阴性组最大(R=0.738)。P₁₆的表达强度随着PI分级的增高而呈明显的下降趋势，即P₁₆的表达随细胞增殖程度的增高而下降。

　　3 讨论

　　基因的改变是导致肿瘤发生的根本原因。1994年初，我们发现了一个重要的新型抑癌基因：MTS1(Multiple Tumor Suppressorl, P₁₆基因)。P₁₆基因缺失与原发性NSCLC有关，而与SCLC无关。在细胞周期的G₁/S交界处的调控机制主要有两方面：一方面是CyclinD(细胞周期蛋白D)对CDK₄(Cyclin-dependent kinases₄，细胞周期蛋白依赖性激酶)的正性调控作用，CyclinD可与CDK₄专一性结合并将其激活，二者结合促进细胞增殖，另一方面就是最近新发现的CDIs家族(Cyclin-dependent kinases Inhibitor CDIs, CDKs的抑制蛋白)的成员P₁₆的负性调控作用，它与cyclinD竞争性结合CDK₄，抑制其活性，使细胞周期停滞在G₁/S交界处，阻止细胞增殖。这两种调控因素平衡变化，保证细胞正常地分裂或分化。PCNA近年来新出现的细胞增殖活性的标志之一，对它的免疫组化研究方法简单，阳性结果肯定，费时短，且可对常规石腊切片作回顾性分析研究，本文采用PCNA作为细胞增殖活性的标志。本研究发现，在68例原发性NSCLC的P₁₆蛋白染色阳性率为67.4%，说明P₁₆基因表达异常在NSCLC中可能并非频发事件，我们将P₁₆蛋白染色阳性率与肿瘤患者的NSCLC组织学分型、细胞增殖程度进行相关性分析后发现，在不同组织类型的NSCLC中P₁₆蛋白的阳性表达率分别为59.4%(鳞癌)、74.2%(腺癌)、40%(未分化大细胞癌)，以腺癌的阳性率最高(74.2%)，但经统计学分析其差异无显著性。另外，P₁₆在不同PI分级中的表达强度不同，P₁₆的表达强度随着PI分级的增高而明显下降，即P₁₆的表达随细胞增殖程度的增高而下降，这可能表明P₁₆基因失活与细胞增殖有关。本研究表明：P₁₆参与NSCLC的细胞增殖周期演进，其不同表达水平直接影响NSCLC的细胞分化与增殖，但与其病理类型无关。

(2000-01-12收稿)