胰腺癌MMP-2和TIMP-2表达与预后的关系
癌症 1999年第5期第18卷 基础研究
作者：贾林 袁世珍 骆福添
单位：贾林 袁世珍，中山医科大学孙逸仙纪念医院消化内科(广州，510120)；骆福添，中山医科大学统计学教研室(广州，510089)
关键词：胰腺肿瘤；金属基质蛋白酶-2；金属基质蛋白酶抑制剂-2；肿瘤转移；预后；免疫组织化学
【摘 要】 目的：探讨胰腺癌组织基质质属蛋白酶-2(MMP-2)和基质金属蛋白酶抑制剂-2(TIMP-2)表达与肿瘤侵袭转移和预后的关系。方法：通过免疫组化方法检测35例胰腺癌病理标本和10正常胰腺标本MMP-2和TIMP-2的半定量表达情况及其与肿瘤临床病理参数和预后的关系，生存分析采用Kaplan-meier方法。结果：胰腺癌MMP-2和TIMP-2表达阳性率明显高于正常对照组，与淋巴结转移和临床分级密切相关，但与胰腺癌的分化程度无关，Kaplan-meier分析发现MMP-2和TIMP-2高表达患者的生存时间明显低于MMP2和TIMP2低表达患者(P＜0.001)。结论：胰腺癌MMP-2和TIMP-2表达与肿瘤侵袭转移和预后密切相关，有助于确定术后治疗方案。
中图分类号：R735.9 文献标识码：A 文章编号：1000-467X(1999)05-0541-04
Prognostic values of matrix metalloproteinase-2 and tissue inhibitor of metalloproteinase-2 expression in pancreatic cancer
JIA Lin,YUAN Shi-zhen,LUO Fu-tian
Department of Digestive Disease,Sun Yat-sen Memorial Hospital,Sun Yat-sen University of Medical Sciences,Guangzhou 510120, P.R. China
【Abstract】 Objective：To investigate the roles of matrix metalloproteinase-2(MMP-2) and tissue inhibitor of metalloproteinase-2(TIMP-2) in tumor invasion and metastasis or as a prognostic factor in patients with pancreatic cancer.Methods：Tissues were obtained from 35 patients with pancreatic cancer and 10 patients without pancreatic disease. Expression of MMP-2 and TIMP-2 was examined by immunohistochemical technique and scored semiquantitatively(score 0-3) in carcinoma cells, and the results were correlated with clinicopathological tumor parameters.Survival analyses were done using the Kaplan-Meire method.Results：Expression of MMP-2 and TIMP-2 was significantly higher in patients with pancreatic cancer than that in normal persons. Expression of MMP-2 and TIMP-2 was significantly correlated with lymph node metastasis and TNM clinical staging sysfem,and did not correlate with histologic classification. Kaplan-Meire analysis revealed an association of increasing MMP-2 and TIMP-2 expression with worse prognosis (P＜0.001).Conclusion：MMP-2 and TIMP-2 are believed to contribute to the invasive properties of pancreatic cancer,which can be used to evaluate the prognosis of patients and may be helpful in designing treatment protocols.
Key words：Mmatrix metalloproteinase-2;Tissue inhibitor of metalloproteinase-2;Pancreatic cancer;Tumor invasion;Prognosis;Immunohistochemistry
肿瘤从原位增殖到侵袭转移的演变过程中，肿瘤细胞必须具备降解细胞外基质(ECM)的能力，基质金属蛋白酶家族(MMPs)和基质金属蛋白酶抑制剂家族(TIMPs)为调节细胞基底膜和细胞外基质完整性的重要因素，与肿瘤的侵袭转移和预后密切相关〔1～3〕，国内外尚未见胰腺癌组织MMP-2和TIMP-2研究与预后关系的报告。我们通过免疫组织化学染色观察人胰腺癌组织MMP-2和TIMP-2的表达情况及其与侵袭转移的关系，旨在探讨MMP-2和TIMP-2表达对胰腺癌患者预后的影响。
1 材料与方法
1.1 标本
35例胰腺癌石蜡标本来自中山医科大学肿瘤医院和孙逸仙纪念医院1969年10月至1997年12月期间的手术切除或活检标本，男性21例，女性14例，所有标本均经病理证实，并对患者进行密切随访。其中高分化腺癌21例、低分化腺癌14例；TNM分期标准Ⅰ和Ⅱ期有18例，Ⅲ和Ⅳ有17例；发生淋巴结转移有19例，未发生淋巴结转移者占16例。10例正常胰腺标本来自意外死亡者。
术后至少每半年对患者随访检查一次，包括体检，血清标志物检测(如CEA、Ca19-9)，腹部超声或CT检查等，并仔细记录患者病情、治疗情况、死亡原因和生存时间，随访截止时间为1997年12月31日。
1.2 免疫组织化学方法
采用SP方法，DAB染色，加强型SP免疫组化试剂盒购自福州迈新公司，一抗为鼠抗人MMP-2和TIMP-2单克隆抗体(美国Oncogen公司产品)，工作浓度为1∶50，TIMP检测需置标本于0.01mol/L枸椽酸钠缓冲液(pH为6.0±0.1)的不锈钢高压锅内进行抗原修复，而MMP-2检测无须特殊处理，用PBS代替一抗作为阴性对照，乳腺癌标本作为阳性对照。如细胞浆内出现棕黄色颗粒为阳性，阳性计数仅限于肿瘤细胞染色，基质染色则予除外。高倍镜下取4个不同视野各计数200个细胞，按阳性细胞所占的百分比进行半定量：0分(阴性)，1分(1％～29％)，2分(30％～69％)，3分(70％～100％)。
1.3 统计学分析
计量和计数资料比较分别采用t检检和χ2检验，生存过程描述采用Kaplan-meier生存曲线法，并行Log-rank检验，当P＜0.05，表明显著性差异。全部资料储存于P133 586型微机内，建立SPSS关系型数据库进行整理，应用SPSS统计软件包进行分析。
2 结果
2.1 胰腺癌组织MMP-2和TIMP-2的表达
研究发现胰腺癌组织MMP-2和TIMP-2的表达均主要位于肿瘤细胞的胞浆，基质细胞表达较少。35例患者中MMP-2中度和强度阳性(2/3分)、弱阳性(1分)和阴性(0分)者分别有19例(54.29％)、10例(28.57％)和6例(17.14％)；10例正常胰腺组织表达微弱阳性者仅有2例(20％)，余均阴性，两组比较有极显著性差异，P＜0.001(见图1)。胰腺癌组织TIMP-2的表达中度和强度阳性、弱阳性和阴性分别为25例(71.42％)、5例(14.29％)和5例(14.29％)，MMP-2和TIMP-2同时有中重度表达的标本有18例(51.43％)；仅10％的正常胰腺组织表达弱阳性的TIMP-2，两组有显著性差异，P＜0.001(见图2)，提示大多胰腺癌组织存在MMP-2和TIMP-2过度表达。
图1 胰腺高分化腺癌。图示MMP-2染色阳性主
要位于胰腺癌细胞胞浆内，基质和正常胰
腺组织少见阳性，利用MMP-2单抗染色，
苏木素复染，SP法×200
图2 胰腺高分化腺癌。(a)图示TIMP-2染色阳性主要位于胰腺癌细胞胞浆内，基质少见阳性，
利用TIMP-2单抗染色，苏木素复染，SP法×200。(b)阴性对照，利用PBS代替TIMP-2单抗染色。
2.2 MMP-2和TIMP-2表达与病理类型的关系
表1显示，胰腺高中分化腺癌MMP-2阳性细胞率评分为1.57±1.16，稍低于低分化腺癌的1.71±0.99，两者无显著性差异(P＞0.50)；而高化腺癌和低分化腺癌的TIMP-2阳性细胞率评分分别1.71±1.01和2.21±1.05，两者也无显著性差异(P＞0.1)，表明胰腺癌组织MMP-2和TIMP-2表达与病理类型无明显相关。
2.3 MMP-2和TIMP-2表达与淋巴结转移和临床分级的关系
发生淋巴结转移的胰腺癌组织MMP-2和TIMP-2阳性细胞率评分均数分别为2.00±0.94和2.21±0.92，分别显著高于未发生淋巴结转移组的1.19±1.11和1.38±0.89，两组均P＜0.05；胰腺癌TNM分期Ⅲ＋Ⅳ患者的MMP-2和TIMP-2阳性细胞率评分显著高于Ⅰ＋Ⅱ分期患者，两组均P＜0.05(见表1)，表明胰腺癌组织MMP-2和TIMP-2表达升高与患者发生淋巴结转移和临床分级密切相关。
表1 胰腺癌组织MMP-2和TIMP-2的表达与病理指标的关系
|
病理指标 |
例数 |
MMP-2 |
TIMP-2 |
|
阳性细胞评分均数 |
P值 |
阳性细胞评分均数 |
P值 |
|
淋巴结转移 |
|
|
|
|
|
|
无 |
16 |
1.19±1.11 |
0.028 |
1.38±0.89 |
0.010 |
|
有 |
19 |
2.00±0.94 |
|
2.21±0.92 |
|
|
分化程度 |
|
|
|
|
|
|
分化高 |
21 |
1.57±1.16 |
0.700 |
1.71±1.01 |
0.172 |
|
分化差 |
14 |
1.71±0.99 |
|
2.21±1.05 |
|
|
TNM分期 |
|
|
|
|
|
|
Ⅰ＋Ⅱ |
18 |
1.11±0.90 |
0.030 |
1.33±0.84 |
0.017 |
|
Ⅲ＋Ⅳ |
17 |
1.82±0.95 |
|
2.12±0.99 |
|
2.4 MMP-2和TMP-2表达与患者预后的关系
Kplan-Meier分析显示MMP-2低表达患者(评分0/1分)有15例，中位生存时间为1462天(约48.73月)，95％CI为601天(284，2640)；而MMP-2高表达患者评分(2/3分)有20例，中位生存时间为161天(约5.33月)，95％CI为36天(90，232)，两组生存时间比较有极显著性差异，P＜0.0001(见图3)。TIMP-2低表达患者(评分0/1分)有10例，中位生存时间为2623天(约87.43月)，95％CI为1602天(0，5762)；而TIMP-2高表达患者(评分2/3分)有25例，其中位生存时间为190天(约6.33月)，95％CI为42天(107，273)，两组生存时间比较有极显著性差异(P＜0.01，见图4)，表明胰腺癌组织MMP-2和TIMP-2的过度表达与患者预后不良明显相关。
图3 MMP-2表达与患者预后的Kaplan-meier
生存曲线，结果显示胰腺癌组织MMP-2
低表达(分数0/1)患者的中位生存时间
为1462天，明显优于MMP-2高表达(分
数2/3)患者的161天，P＜0.0001
图4 TIMP-2表达与患者预后的Kaplan-meier
生存曲线，结果显示胰腺癌组织TIMP-2
低表达(分数0/1)患者的中位生存时间
为2623天，明显优于TIMP-2高表达(分
数2/3)患者的190天，P＜0.01
3 讨论
MMPs是一组锌离子依赖性内肽酶，几乎能降解细胞外基质的所有成分，参与胎儿发育过程中的组织重构(tissue remodeling)和伤口愈合过程中的胶原重构等生理过程。而在病理情况下，MMPs一方面通过降解基底膜和包绕肿瘤的基质，突破基质屏障，促进肿瘤侵袭转移，另一方面则通过毛细胞血管内生、新生血管生成等促进肿瘤生长和扩散，TIMPs则具有抑制MMPs活性的作用。体内外试验也证实MMP的人工合成抑制剂Batimastat(BB-94)能有效抑制肿瘤的生长和转移〔3〕。Ⅳ型胶原酶包括MMP-2和MMP-9两个亚型，KoshibaT等发现在胰腺癌组织及其肝转移结节和正常胰腺组织中均可表达MMP-9，而MMP-2则仅在所有胰腺癌组织及其转移结节中表达，正常胰腺则未发现，认为MMP-2对胰腺癌的特异性较高〔4〕。而BramhallSR(1997)进一步发现胰腺癌标本MMP-2表达水平明显高于正常胰腺，仅半数胰腺癌标本表达TIMP-2，MMP-2和TIMP-2同时表达的标本仅50％，认为MMP-2的表达与胰腺癌的恶性表型相关〔5〕。本文免疫组化研究显示胰腺癌组织MMP-2和TIMP表达主要位于肿瘤细胞浆和胞膜，其表达阳性率均明显高于正常胰腺组织，MMP-2和TIMP-2同时中重度阳性的标本达51.43％，但分别有20％和10％的正常胰腺组织可表达弱阳性的MMP-2和TIMP-2。
研究发现肿瘤组织MMPs的表达和活性明显高于周围正常组织和良性病变，MMP-2的过度表达与肿瘤的淋巴结转移和血行转移密切相关；酶谱分析显示活性MMP-2的比率与肝癌和胃癌的浸润转移成正相关〔2，6〕。本研究显示胰腺癌淋巴结转移组的MMP-2和TIMP-2阳性细胞率评分显著高于未发生淋巴结转移组，胰腺癌TNM分期Ⅲ＋Ⅳ显著高于Ⅰ＋Ⅱ分期，但与胰腺癌的分化程度无关，表明胰腺癌组织的MMP-2和TIMP-2表达与患者淋巴结转移和临床分级密切相关。
MMP-2和TIMP-2表达与肿瘤预后关系的研究于近年受到重视，对其预后评估价值尚有争议。胃癌标本免疫组化和生存分析研究发现弥漫型胃癌组织MMP-2高表达组(2/3分)和低表达组0/1分)患者的无病率(disease-free)和总体生存率(cverall survival)有显著性差异(P=0.0056)，MMP-2可作为弥漫型胃癌患者预后的独立预后指标〔2〕。膀胱癌免疫组化研究发现膀胱癌患者MMP-2与患者组织学分级和预后无关，而TIMP-2表达与患者预后密切相关〔7〕。KanayamaHO等(1998)利用RT-PCR方法和Kaplan-Meier分析进一步发现膀胱癌组织MMP-2和TIMP-2的基因均高表达，与膀胱癌肌层浸润密切相关；在膀胱切除组的肌层浸润PT2≤患者中，MMP-2和TIMP-2基因高表达患者的预后明显较低表达患者险恶，并建议用于预后评估和确定术后治疗策略〔1〕。本文首次进行胰腺癌术后标本MMP-2和TIMP-2的表达与预后的关系探讨，Kaplan-Meier分析发现胰癌组织MMP-2和TIMP-2高表达组患者的预后不佳，其生存时间仅为MMP-2低表达组患者生存时间的1/9，提示胰腺组织MMP-2和TIMP-2表达可用于患者的预后评估，对MMP-2和TIMP-2高表达患者应行术后化疗或放疗等辅助治疗措施。
总之，本文单因素分析显示胰腺癌组织MMP-2和TIMP-2表达与胰腺癌的侵袭转移和预后密切相关，MMP-2和TIMP-2高表达患者的预后较差。至于MMP-2和TIMP-2是否为胰腺癌独立的预后评估因素，尚待进一步积累资料和进行COX模型分析。
(致谢中山医科大学孙逸仙纪念医院病理科李海刚医生的指导)
〔参考文献〕
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收稿日期：1999-03-26；修回日期：1999-06-03
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