人胰腺癌p16蛋白的表达及意义
江苏医药 2000年第7期第26卷 短篇论著
作者:周家华 杨德同 孙桂勤 姚青 尹克铮 汤文浩
单位:周家华 杨德同 汤文浩(南京铁道医学院第一附属医院胆胰外科 210009);姚青 尹克铮(病理科);孙桂勤(南京军区南京总医院病理科)
p16基因是抑癌基因,其表达的p16蛋白是调节细胞周期的主要成分,我们用免疫组织化学技术,对35例原发性胰腺癌的p16蛋白表达进行研究,探讨其在胰腺癌发生、病理学特征及临床分期的关系。
一、材料与方法
一、材料
1.标本采集:35例人胰腺癌患者癌组织及癌旁正常组织,其中12例为外科新鲜标本,23例为石蜡块标本,分别由本院、江苏省人民医院、江苏省肿瘤医院提供并鉴定。男女比为4∶3,年龄最大74岁,最小19岁,平均59岁。
2.试剂:免疫组化试剂p16蛋白抗体(1∶100)(Santa cruz)、即用型LSAB试剂盒(DAKO公司)、DAB试剂盒(SABC),组织学检测用常规HE染色。
二、方法
1.采用LSAB技术:石蜡包埋组织作4 μm厚的切片,常规脱蜡水化,将切片于0.01M柠檬酸盐缓冲液中(pH6.0),微波炉煮沸10 min修复抗原,取出待冷却至室温后,用蒸馏水洗三次,继用0.3%H2O2-甲醇常温下孵育切片10’,以阻断内源性过氧化物酶,擦去周围PBS,滴加封闭剂,置切片于湿盒中孵育37℃20’,吸去封闭剂(勿洗),用p16抗体1∶20浓度滴加,37°孵育1小时,4°湿盒过液,切片用PBS洗3×5’,滴加LSAB二抗工作液(即ABC)置切片于湿盒中37°孵育30’,PBS洗3×5’,将DAB以DAB工作液稀释50倍滴加到切片上,显色5’-10’(在显微镜下控制显色)后用自来水冲洗3’终止,用苏木素复染1-1.5’,冲洗10’,脱水、透明、封片、镜检。
对照:其中以已知的乳腺癌p16阳性切片做阳性对照,以PBS代替一抗作阴性对照,以正常胰腺组织作正常对照。
2.结果判定:以胞浆染成棕黄色颗粒作为阳性判断标准,按无阳性瘤细胞或阳性瘤细胞数表达<10%为阴性,阳性瘤细胞细胞数表达<25%为“+”,细胞数占25%~50%为“++”,细胞数>50%为“+++”。
3.统计学分析用四格表精确概率法及列联表精确概率法处理。
二、结果
1.分析发现有21个标本出现不同程度的p16蛋白表达下降(12例阴性,9例“+~++”),占60%见表1。
表1 人胰腺癌p16蛋白表达情况
表达程度 |
病例数 |
- |
12 |
+ |
6 |
++ |
3 |
+++以上 |
14 |
注:p16蛋白表达下降与p16蛋白表达+++相比,差异显著(P<0.05)
2.p16蛋白表达异常与胰腺癌分化程度的关系见表2。
表2 p16蛋白表达异常与胰腺癌分化程度的关系
分化程度 |
p16蛋白表达下降 |
p16蛋白表达未下降 |
低 |
1 |
4 |
中 |
10 |
7 |
高 |
10 |
3 |
注:中低分化蛋白表达下降为66%,而高分化蛋白表达下降为20%,但差异不显著(P>0.05)
3.p16蛋白表达异常与胰腺癌TNM分期的关系见表3。
表3 p16蛋白表达异常与胰腺癌TNM分期的关系
TNM分期 |
p16蛋白表达异常 |
|
表达下降 |
表达正常 |
Ⅰ |
2 |
3 |
Ⅱ |
4 |
8 |
Ⅲ |
12 |
3 |
Ⅳ |
3 |
2 |
注:Ⅲ期与Ⅰ期+Ⅱ期相比有明显的差异性P<0.05(FI=5.67)
Ⅲ期与Ⅰ期+Ⅱ期+Ⅳ期相比有明显的差异性P<0.05(FI=5.43)三、讨论
p16基因是第一个被证明为肿瘤抑制基因的细胞调控机制的内在成分,是近年来肿瘤分子生物学研究的一个热点,研究发现p16基因与胰腺癌有较为密切的关系[1,2]。
p16蛋白选择性的抑制CDK4,当p16基因变异影响p16蛋白的结构和功能而表达下降时,导致细胞周期抑制作用消失,产生肿瘤。基因缺失、突变、甲基化是引起p16蛋白表达下降的主要原因。在细胞中野生型p53蛋白含量少,且半衰期短仅6~20分钟,因此用一般的免疫组化检测到的p53蛋白为突变型,而野生型p16蛋白与之相反,所以用一般的免疫组化检测到的p16蛋白是野生型而非突变型,有较高的临床应用价值。本文用敏感的LSAB方法对35例胰腺癌进行p16蛋白表达研究,有21个标本出现不同程度的p16蛋白表达下降(12例阴性,9例“+~++”)占60%(与基因缺失和突变基本吻合,论文另发)从而证实了p16基因突变参与了人胰腺癌的发生。
一般认为人胰腺癌分化程度低、浸润广泛、及临床分期处于Ⅲ~Ⅳ期的病人预后较差。统计学分析表明p16基因蛋白表达异常与人胰腺癌性别、年龄及病理类型无明确的关系;分化程度高的人胰腺癌标本p16蛋白表达下降率为20%(1/5),而中低分化蛋白表达下降率为66%(20/30),说明分化程度差p16失活高,但统计学无差异,可能与病例少有关。统计学分析表明p16蛋白表达异常与临床分期Ⅲ期有明确的关系。Detlf Bartsh[3]报道p16基因突变与胰腺癌Ⅲ期有相关性,发生p16突变的病人平均存活5.5个月,无p16突变的病人平均存活19个月,差异明显。Naka T[4]用免疫组化方法检测p16蛋白表达,发现p16蛋白表达阴性与临床分期有关,5例p16蛋白表达阳性的病例存活3年,而阴性病例很短。说明p16蛋白的检测对人胰腺癌的诊断及预后判断有重要的临床意义。
参考文献
1,Caldas C,Hahn SA,da Costa LT,et al.Frequent somatic mutation and homozygous deletions of p16(MTS1) gene in pancreatic adenocarcinoma.J Nat Genet,1994,8:27.
2,Muscarella P,Melvin WS,Fisher WE,et al.Genetic alteration in gastrinomas and nonfunctioning pancreatic neuroendocrine tumor:a analysis of p16/MTS1 tomur suppressor gene inactivation.J Cancer Res,1998,58(2):237-40.
3,Bartsch D,Shevlin DW,Callery MP,et al.Reduced survical in patients with ductal pancreatic adenocarcinoma associated with CDKN2 mutation.J Nat cancer Inst,1996,88:680.
4,Naka T,Kobayashi M,Ashida K,et al.Aberrant p16INK4 expression related to clinical stage and prognosis in patients with pancreatic cancer.Int J Oncol,1998,12(5):1111-6.