人胰腺癌细胞血管生成过程的观察及意义
中华实验外科杂志 1999年第3期第16卷 胰腺外科
作者：孙立波 张德恒 朱立元 田力 赵录 何尔斯泰
关键词： 胰腺癌；血管生成；活体显微镜
【摘要】 目的 探讨人胰腺癌血管生成方式和时间，分析其临床意义，为寻求抗人胰腺癌血管生成药物做准备。方法 用SCID鼠制做皮肤血管室模型，血管室内接种人胰腺癌细胞株，活体显微镜下连续观察2周，录制图像，使用图像分析软件比较血管面积、密度及直径的变化。结果 1周内新生血管基本完成，2周内形成肉眼可见的微小肿瘤；血管密度和面积的变化显著(P＜0.001，P＜0.01)；血管直径的变化差异无显著性(P＞0.05)。结论 人胰腺癌细胞可诱导周围正常血管内皮细胞增生形成肿瘤血管；胰腺癌术后的辅助治疗应开始于术后2周以内；血管密度可作为估计胰腺癌恶性程度高低的生物学指标。
Observation of the angiogenesis process of human pancreatic cancer cells and its clinical implication
SUN Libo, ZHANG Deheng, ZHU Liyuan, et al.
Department of General Surgery, The Third Clinical College, Norman Berthune University of Medical Sciences, Changchun 130031
【Abstract】Objective To investigate the angiogenesis process of human pancreatic cancer cells (HPCC) and its clinical implication.Methods Cancer cells were implanted into the dorsal skinfold chamber on SCID mice and angiogenesis process was continuously observed with introvital videomicroscopic system for two weeks. Imaging analysis software was used to compare the changes in vascular area (VA), vascular density (VD) and vascular diameter.Results HPCC could form their own new vasculature from surrounding normal microvessels in one week, and visible microtumors in the chamber could be found in two weeks. The changes in VD and VA were significant as compared with control group (P＜0.001, P＜0.01 respectively).Conclusions HPCC could induce angiogenic agents which stimulate the proliferation of surrounding endothelial cells and form new tumor vasculature. Antiangiogenic therapy might be used to treat this disease. Postoperative adjuvant treatment should be given as earlier as possible. VD might be used as a good indicator of the malignant extent of human pancreatic cancer.
【Key words】 Human pancreatic cancer Angiogenesis Introvital microscope
我们应用活体显微镜技术，结合录像及微机软件分析系统对人胰腺癌细胞的血管生成过程进行观察，现报道如下。
材料与方法
1.细胞 人胰腺癌细胞株(PK-1)由日本东北大学医学部第一外科建立［1］。使用RPMI1640培养液，附加体积分数为10%的牛胎儿血清，L-谷氨酸，并加入青霉素、链霉素及庆大霉素防止感染。细胞在体积分数5%CO2孵箱中37 ℃恒温条件下培养。
2.动物 雄性6周龄SCID鼠，分为正常对照组和实验组。
3.皮肤血管室的制做 方法与文献报道的相同［2］，简述如下：苯巴比妥麻醉(50mg/kg体重)。背部去毛后，无菌条件下将皮肤嵌入两个对称的钛制金属框架中。一层皮肤以直径1.5 cm圆形切除，同时剥除另一层皮肤的收缩筋膜。用透明玻片覆盖带有丰富血管网的皮肤内侧面，注意保持2 mm左右的间距，以便3天后种植肿瘤细胞。
4.肿瘤细胞的种植 细胞近90%融合时，用胰酶脱壁收集，培养液洗涤后离心。将吸量管调到2 μl，直接吸取沉淀细胞(约1×106个)，然后种植于血管室内纹状肌表面(图1)。细胞接种后动物单独饲养，很快适应血管室固定架，无不良反应。
5.活体显微镜观察 将动物在清醒状态下固定于有机玻璃管所制固定架中，然后在活体显微镜下(OPTIPHO66，Nikon, Tokyo)以2×、4×、10×、20×观察血管室内血管生成情况，每日1次连续2周。为增强血管显影效果，经尾静脉注入0.2ml 10%FITC标记的葡萄聚糖。观察到的血管图像由显微镜上方的摄像镜头传入电视监视屏幕上，录制的高倍图像用于血管参数分析。
6.血管图像分析 血管图像输入微机后由NIH软件分析系统摄像“off line”制图，然后按文献［2］检测血管面积、密度(VD)和直径。
7.统计学方法 t检验。
结果
1.人胰腺癌细胞的血管生成过程 人胰腺癌细胞接种后第3天可见其周围正常毛细血管变形，有新生毛细血管向肿瘤接种处延伸：1周时血管网基本形成(图2)：2周时血管室内形成肉眼可见的微小肿瘤，周围伴有丰富的毛细血管，处于明显增长状态(图3)。
图1 肿瘤细胞刚接种时的图象，半透明的肿瘤细胞被周围正常的皮肤毛细血管包饶(4X)
图2 肿瘤细胞接种后1周时由周围正常毛细血管新生形成的肿瘤血管网(4X FITC光源)
图3 肿瘤细胞接种后2周时肉眼可见的血管室内微小肿瘤(4X FITC光源)
2.血管参数的变化 2周后肿瘤表面的血管面积与未接种肿瘤细胞的正常对照组相比差异有显著性(P＜0.01)；VD的差异有非常显著性(P＜0.001)；血管直径的对比差异无显著性(P＞0.05)(图4)。
图4 实验组与对照组间血管参数的比较
讨论
1.血管生成在胰腺癌治疗中的意义 我们的研究结果表明人胰腺癌细胞的生长与其他肿瘤细胞的生长一样［3-5］，首先要获得丰富的营养血管，营养血管的生成来自周围正常的毛细血管，这一结果提示人胰腺癌细胞本身能够分泌血管生成因子，传递给周围正常的血管内皮细胞，使血管新生化。因而抗人胰腺癌血管生成的治疗可从两方面入手。一是从各个环节抑制血管生成因子与受体的结合，阻断其作用；另一方面是抑制胰腺癌细胞血管生成因子的分泌，从根本上抑制肿瘤血管生成的始动因素［4，5］。本实验结果显示，人胰腺癌细胞1周左右血管生成已基本完成，2周左右肿瘤已明显增长，提示临床上胰腺癌的辅助治疗应开始于术后2周以内，否则残留的癌细胞很快获得丰富的营养血管，形成新的微小肿瘤，不利于各种辅助疗法的治疗效果。
2.血管参数变化的临床意义 在众多的血管参数指标中，以VD最受重视。研究表明VD是区别肿瘤良恶性的一个可靠指标，与乳腺癌等恶性肿瘤的侵润、转移、复发及预后有明显的相关性［4-6］。本研究结果显示，胰腺癌的形成与增长建立于高密度的血管生成基础之上。所用的胰腺癌细胞临床上表现为高度恶性，用该细胞株建立的赶转移模型也表现出较高的转移率［1］，提示胰腺癌的VD与其临床发展及预后有明显的相关性。VD这一参数可能是区别胰腺癌恶性程度的高低、预测转移、复发及预后的一个良好指标。
参考文献
1 Kimura Y, Kobari M, Yusa T, et al. Establishment of an experimental liver metastasis model by intraportal injection of a newly derived human pancreatic cancer cell line (KLM-1). International Journal of Pancreatology, 1996, 20:43-50.
2 Borgstrom P, Hilan KJ, sriramarao P, et al. Complete inhibition of angiogenesis and growth of microtumors by anti-vasvular endothelial growth factor neutralizing antibody: Novel concepts of angiostatic therapy from intravital videomicroscopy. Cancer Res, 1996,56:4032-4039.
3 Pluda JM, Parkinson DR. Clinical implications of tumor-associated neovascularization and current antiangiognecic strategies for the treatment of malignancies of pancreas. Cancer, 1996, 78:680-687.
4 Folkman J. Tumor angiogenesis and tissue factor. Nature Medicine, 1996, 2:167-168.
5 佐藤靖史.血管新生因子.肝胆月萃，1996，33：165-169.
6 Weinde N. Intratumoral microvessel density as a prognostic factor in cancer. Am J Pathl, 1995,147:9-19.
(收稿：1998-05-29)
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