胰腺癌p16基因mRNA异常表达的研究

中华实验外科杂志 2000年第2期第17卷 简报

作者：周建平　詹勇　李继光　郭仁宣　刘红波

单位：(110001　沈阳，中国医科大学附属第一医院普外二科)

　　我们应用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测胰腺癌中p16基因mRNA的表达情况，同时应用聚合酶链式反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)对其异常表达的原因进行分析，现将结果报道如下。

　　一、材料和方法

　　1.对象：新鲜胰腺癌组织10例取自中国医科大学第一临床学院普通外科手术切除的肿瘤标本，其中胰头癌9例为胰头十二指肠手术切除，胰体尾癌1例为胰体尾切除术切除。正常胰腺组织7例为对照，取自十二指肠乳头癌和胆管末端癌行胰头十二指肠切除的正常胰腺。

　　2.DNA和RNA的提取：酚-氯法提取上述样品DNA，紫外分光光度法测定DNA的纯度和浓度；新鲜冰冻标本50～100 mg样品，用无菌剪刀剪碎，小心移入匀浆器内，加2.5倍体积Trizol，冰上加等体积异戊醇混匀，12 000 r/min离心30 min，弃上清；体积分数为70%乙醇漂洗沉淀2次，干燥，溶于200 μl去离子水；电泳观察结果；用紫外分光光度计测定RNA浓度，-20℃保存备用。

　　3.RT-PCR：(1)逆转录合成cDNA：逆转录体系为20 μl。在EP管内依次加入5 μl RNA样品，1 μl 50 mmol/L OligodT(12～15)，6 μl 15倍酶缓冲液，1.5 μl dNTPs,20 U AMV逆转录酶。逆转录条件为室温10 min,42℃ 1 h，85℃ 5 min，4℃ 15 min。(2)PCR扩增　取5 μl逆转录产物进行PCR扩增。用RNA样品作为模板直接扩增作为阴性对照，以排除因为DNA污染引起的假阳性结果。所用引物为p16s9-GGAGCATGGAG;p16s13-GGCCCTGTAGGATTC(引物序列由大连宝生物公司合成)，应用PTC-200扩增仪(MJ公司)。反应体系由25 μl组成，其中包括RNA样品5 μl，引物2 μl，5%二甲基亚枫1 μl，dNTP 1 μl，10×PCR。反应缓冲液2.5 μl和1 UTaq DNA聚合酶(dNTP PCRbuffer和Taq酶皆购自Biostar Company,Canada)。反应条件95℃ 6 min，68℃ 30 s，72℃ 2 min 1个循环；95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 2 min 45个循环；95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 10 min 1个循环。扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色观察^［1］。

　　4.PCR-SSCP：(1)以上述方法提取的DNA样品为模板，扩增p16基因第1外显子和第2外显子片段^［2］。以β-球蛋白基因为内参照。以正常胰腺组织提取DNA为阳性对照，每次扩增都设置阴性对照。反应体系及反应条件同上述扩增。(2)单链构象多态性分析PCR扩增产物，外显子1为340 bp，外显子2为509 bp。外显子2扩增产物经限制性内切酶SmaI酶切，37℃温箱中过夜，将外显子2片段切割成249 bp和260 bp 2个小片段。取扩增产物8 μl置于96℃加热6 min，立即放于冰水混和物中，使DNA变性为单链。10%聚丙烯酰胺凝胶电泳3 h，电泳结果用体积分数为7.5%乙酸固定10 min，去离子水漂洗3次，每次2 min，加入硝酸银溶液轻轻晃动5 min，弃银溶液后用去离子水漂洗10 min，加入显影液振荡直至染色条带出现，7.5%乙酸终止反应，观察结果^［3］。

　　5.统计学分析：Fisher精确概率法。

　　二、结果

　　10例胰腺癌组织中有4例检测出p16基因mRNA正常表达，6例mRNA不表达，异常表达率达60%。对照组胰腺组织7例均检测出p16基因mRNA正常表达。我们对mRNA未表达的6例胰腺癌进行PCR-SSCP检测，结果其中4例发生了第2外显子的纯合性缺失，有1例发生了第1外显子的突变，第2外显子缺失率40%，对照组7例均未发现第1和第2外显子的缺失和突变。

　　三、讨论

　　p16蛋白与CDK4竞争性的抑制cyclinD-CDK4复合物的形成，使视网膜母细胞瘤蛋白(Rb蛋白)不能正常的磷酸化，无法释放转录因子，从而抑制了细胞周期G₁-S期的转变，抑制了CDK4的促细胞增殖作用。如果p16基因发生了异常改变则丧失了对细胞周期的抑制功能，导致正常细胞周期的失控，细胞发生不可逆的分裂增殖，导致肿瘤的形成。

　　p16基因mRNA的表达情况决定了p16蛋白的表达。我们应用RT-PCR技术检测了10例胰腺癌和7例正常胰腺组织中p16基因mRNA的表达情况，统计学分析表明两者之间相比差并有显著性(P＜0.05)，p16基因mRNA的异常表达与胰腺癌的发生关系密切。p16基因第2外显子的缺失是引起mRNA异常表达的重要原因，但mRNA异常表达率超过了其DNA水平的缺失和突变率，表明除了缺失和突变尚有其他引起p16基因mRNA异常表达的原因。

　　参考文献

　　1，Micheal Naumann, Natalia Savitskaia, C-hristina Eilert, et al.Frequent Codeletionof p16/MTS1 and p15/MTS2 and Genetic Alterations in p16/MTS1 in Pancreatic Tumors. Gastroenterology, 1996,110:1215-1224

　　2，Kamb A, Gruis NA,Feldhaus JW, et al.A cell cycle regulator potentially involved in genesis of many tumor types.Science， 1994,264：436-439.

(收稿日期：1999-09-08)