Western印迹杂交分析p53蛋白在人鼻咽癌中的表达及其意义

中国免疫学杂志 2000年第4期第16卷 肿瘤免疫学

作者：郑美莲　区宝祥　龙江斌　邓满泉　陈丽珍　梁启万　李辉梅

单位：郑美莲（中山医科大学肿瘤防治中心，广州 510060）；区宝祥（中山医科大学肿瘤防治中心，广州 510060）；龙江斌（中山医科大学肿瘤防治中心，广州 510060）；邓满泉（中山医科大学肿瘤防治中心，广州 510060）

关键词：鼻咽肿瘤；p53基因；蛋白质印迹法

　　摘　要　目的：检测104例鼻咽癌活检组织和8例鼻咽粘膜慢性炎症组织 中p53蛋白的表达。方法：采用Western印迹法结合免疫沉淀技术。结果：104例鼻咽癌活检组织中有12例出现突变型p53蛋白表达，突变检出率 为11.54%(12/104)；8例鼻咽慢性炎症活检组织中未见p53蛋白的异常表达(0/8)；鼻咽癌病 人中人IgA/VCA抗体滴度≥1∶160者，p53蛋白突变检出率为11.80%(11/93)，IgA/VCA抗 体 滴度≤1∶80者，p53蛋白突变检出率为9.10%(1/11)，IgA/EA抗体滴度阳性者，p53蛋白突变 检 出率为14.10%(11/78)，IgA/EA抗体滴度阴性者，p53蛋白突变检出率为3.80%(1/26)；12例p 53蛋白异常表达 的鼻咽癌病人中有2例复发。结论：突变型p53基因产物的表达与鼻咽癌 EB病毒早期抗原有关，p53基因在鼻咽癌中可能发挥一定的作用。

　　中国图书分类号　R739.63

Western blot analysis of p53 protein expressio n in human nasopharyngeal carcinoma

ZHENG Mei-Lian　OU Bao-Xiang　LONG Jiang-Bin

　　（Canc er Institute,Sun Yet-Sen University of Medical Science,Guangzhou 510060）

　　Abstract　Objective：To investigate the role of p53 protei n expression in nasopharyngeal carcinoma.Methods:104 human primary nasopharyngeal carcinoma and 8 nasopharyngeal chronic inflammation biops y were examined for p53 protein expression with Western blot hybridization and i mmunopercipitation techniques.Results:The 104 nasopharyng eal carcinoma biopsy 12(11.54%) showed abnormal expression of p53 protein.Abnorm al expression of p53 protein was not found in 8 biopsy of the nasopharyngeal chr onic inflammation(0/8). The protein abnormal of p53 gene were 11.80%(11/93) and 9 .10%(1/11) in nasopharyngeal carcinoma with EBV-IgA/VCA≥1∶160 and EBV-IgA/VC A ≤1∶80, respectively. The p53 protein positive rates of mutation-type were 14. 10% (11/78) and 3.80%(1/26),respectively in nasopharngeal carcinoma with EBV-IgA/EA positive and negative. 2 patients were found the cancer recurrence in 12 patien ts o f p53 protein abnormal expression.Conclusion:p53 protein e xpression may play a role in nasopharyngeal carcinoma.

　　Key words　Nasopharyngeal neoplasms　p53 genes　Western blo t

　　p53基因具有双重性，即野生型(wild type)p53 基因具有抑癌作用，突变型(mutant type)p 53 基因为致癌基因。p53基因结构改变及表达异常是人类肿瘤中常见的现象之一^［1］ 。p53蛋白在鼻咽癌中的研究报道不多，而且迄今为止，p53蛋白在鼻咽癌的研究大多采用 免疫组织化学的方法。我们采用Western blot结合免疫沉淀分子生物学技术检测p53蛋白 在鼻咽癌中的表达，旨在探讨p53蛋白表达与鼻咽癌的关系及其临床意义。

　　1　材料与方法

　　1.1　标本来源　鼻咽组织采自本院确诊为鼻咽 癌的初诊患者鼻咽纤维镜的检测标本。104例活检标本病理检查确诊为鼻咽癌，取8例鼻咽粘 膜慢性炎症标本作为对照。

　　1.2　组织蛋白的提取　鼻咽癌活检组织取出后，在冰浴下用玻璃研磨器磨 碎标本，然后加入细胞裂解液裂解细胞，超声波处理(7 micro 30 s 4次，每次间隔1 min) 离心，取上清，测定总蛋白含量。

　　1.3　免疫沉淀　用Oncogene Science公司p53单克隆抗体，根据抗体说明进 行标本处理。p53抗体15 μl与细胞裂解物1 ml进行免疫沉淀。p53抗体是一种与Protein A ag arose结合的小鼠抗p53单克隆抗体，可把裂解物中的p53抗原沉淀，形成抗原抗体复合物。p 53靶蛋白沉淀后，弃上清液，沉淀物经洗涤后加入强阴离子去污剂SDS加样缓冲液(sample b uffer)，使靶蛋白与抗体解离，然后用Western印迹法检出特异的p53蛋白。

　　1.4　Western blot　已溶解于加样缓冲液的沉淀物在15% SDS聚丙烯酰胺凝 胶电泳分离，电转移至硝酸纤维膜上，用1∶30稀释p53抗体(小鼠单克隆抗体)进行Western blot，然后用1∶300稀释的二抗(碱性磷酸酶偶联的羊抗小鼠IgG)处理，采用DAB显色试剂盒 检测、摄影。

　　2　结果

　　2.1　鼻咽癌组织Western blot结果　104例鼻咽癌检测标本中，有12例出现 p53蛋白表达异常的条带(见图1)，突变检出率为11.54%。8例鼻咽慢性炎症检测标本中p53蛋 白表达均未见异常，突变检出率为0。

图1　鼻咽癌组织Western blot结果

　　Fig.1　Western blot analysis of p53 proteins

　　in NPC cell biopsis Note:M:mar ker;1-9： NPC biopsis;

　　3,4,6,8,9：abnormal expression of p53 protein;10：normal control

　　2.2　鼻咽癌p53蛋白的异常表达与病理类型和临床分期的关系　104例鼻咽 癌标本中，除了2例鼻咽未分化癌，1例泡状核细胞癌，其余均为鼻咽低分化鳞癌。12例出现 p53蛋白异常表达的标本，病理诊断均为鼻咽低分化鳞癌。104例鼻咽癌标本中包括了Ⅰ～Ⅳ 期的病人。出现p53蛋白异常表达的12例标本中Ⅰ期为1例，Ⅱ期3例，Ⅲ期5例，Ⅳ期2例， 另外有1例分期不明。

　　2.3　p53蛋白异常表达与EB病毒感染的关系　104例鼻咽癌病人中， EB病毒壳抗原免疫球蛋白A(IgA/VCA) 抗体滴度≥1∶160有93例，其中p53蛋白表达异常者有11例，突变检出率为11.80%； IgA/VCA抗体滴度≤1∶80有11人，其中p53表达异常者1例，突变检出 率为9.10%。104例鼻咽癌检测标本中，IgA/EA阳性者有78例，其中p53蛋白异常者有11例， 占14.10%，IgA/EA阴性者26例，其中p53蛋白表达异常者1例，占3.80%。

　　2.4　鼻咽癌p53蛋白表达异常与预后的关系　本文研究的104例鼻 咽癌病人中，发现有2例病人复发，这2例病人均为p53蛋白表达异常，其中1例为Ⅱ期病人，放疗结 束后14个月复发，另外1例为Ⅳ期病人，放疗结束后10个月复发。追踪观察病人3～4年 所研究的这104例鼻咽癌病人均未发现有肿瘤转移。

　　3　讨论

　　鼻咽癌的发生、发展与EB病 毒感染相关，为了解p53基因与EB病毒的关系，本文研究了鼻咽癌病人p53表达产物与EBV 感染的关系。研究表明93例IgA/VCA抗体滴度≥1∶160的病人中有11例存在突变型p53蛋白表 达，突变检出率为11.80%，11例IgA/VCA抗体滴度≤1∶80病人中检出1例存在突变型p53蛋白 表达，突变检出率为9.10%。IgA/EA抗体滴度阳性的鼻咽癌病人中p53蛋白突变检出率为14.1 0%，而IgA/EA抗体滴度阴性的鼻咽癌病人中p53蛋白突变检出率为3.80%。 因为EB病毒早期抗原(EA)是EB病毒周期的早期产物，EA抗体能反映EB 病毒在体内感染的活动程度。本文检出的突变性p53蛋白绝大多数是EA抗体阳性鼻咽癌病人 。结果还表明p53蛋白表达异常者大多数是IgA/VCA抗体滴度高，而且是IgA/EA抗体滴度阳性 的病人。迄今已发现许多恶性肿瘤存在p53基因突变，但不同的肿瘤有不同的突变率^{［2 ，3］}。本文检测104例鼻咽癌 活检标本中，发现有12例鼻咽癌标本显现突变型p53蛋白条带，但对临床怀疑鼻咽癌、病理 确诊为鼻咽粘膜慢性炎症病人标本进行了p53蛋白检测未发现有异常表达现象。研究结果表 明p53蛋白的异常表达只出现在鼻咽癌病人，鼻咽粘膜慢性炎症的非癌病人则未见异常，而 且鼻咽癌不仅在晚期(Ⅲ、Ⅳ期)，在早期(Ⅰ、Ⅱ期)也有p53蛋白异常表达存在。但从初步 的实验结果看，鼻咽癌p53蛋白的异常表达多见于恶性程度较高、分期较晚、IgA/VCA高滴度 和IgA/EA阳性的病例，但尚未发现p53蛋白异常表达与病程进展的关系。有文献报道鼻咽癌 中p53突变率小于10.00%^［4］。本文所研究的104例鼻咽癌均为原发癌，p53蛋白突变 检 出率(12/104)为11.54%，结果相近。我们的试验采用Western blot结合免疫沉淀技术检 出的 蛋白条带均为突变型p53蛋白，此法检测基因表达产物较为特异和客观。特别值得注意的是 ，在我们所检测的104例鼻咽癌活检组织中，经过3～4年追踪观察发现有2例病人鼻咽癌复发 ，而且2例病人均为p53蛋白的表达异常者，其中1例为Ⅱ期病人，IgA/VCA为1∶1 280，放疗 治愈后16个月复发，另1例为Ⅳ期病人，IgA/VCA为1∶320，放疗治愈后10个月复发，其余 p53蛋白的表达未见异常的鼻咽癌病例均未发现有复发现象，表明p53基因突变可能与鼻咽癌 预后有一定关系。上述结果提示，鼻咽癌发生、发展过程中，鼻咽部从癌前病变到癌症，发 生了一系列的病理变化，从分子生物学水平分析，p53基因表达产物也发生了一定的变化， 说明p53基因在鼻咽癌中可能发挥一定作用。

　　本课题为美国中华医学基金会(CMB)赞助(No.90-529)

　　作者简介：郑美莲, 女, 54岁，副研究员

　　陈丽珍（中山医科大学肿瘤防治中心，广州 510060）

　　梁启万（中山医科大学肿瘤防治中心，广州 510060）

　　李辉梅（中山医科大学肿瘤防治中心，广州 510060）

　　4　参考文献

　　1，Hollstein M,Sidransky D, Vogestein B et al. p53 mut ation in human　cancer. Science,1990；253(5019):491

　　2，Gimenez-Conti I B, Collet A M,Lanfranchi H et al. p53 Rb a nd cyclin D1 expression in human oral verrucous carcinomas. Cancer,1996;78(1):17

　　3，Gan H, Wang L A,Zhou Q et al. p53 tumor suppressor gene mutati o n early esophageal precancerous lesions and carcinoma among high-risk populatio n in henan China. Cancer Res,1994;54(16):4342

　　4，Sun Y,Hegamyer G H,Cheng Y J et al. An infrequent point mutatio n of the p53 gene in human nasopharyngeal carcinoma. Proc Natl Acad Sci USA,1992 ;89(14):6516

［收稿1999-03-02］