鼻咽癌肿瘤细胞增殖与凋亡关系

安徽医科大学学报 2000年第2期第35卷 基础医学研究

作者：李华　孟刚　龚西騟　杨枫

单位：安徽医科大学病理学教研室，合肥　230032

关键词：鼻咽肿瘤；病理学；增殖细胞核抗原；凋亡；基因；bcl-2

　　摘要　目的　了解鼻咽癌肿瘤细胞增殖与凋亡的关系及bcl-2表达在此过程中的作用。方法　65例鼻咽癌活检组织及15例癌旁组织用免疫组化技术检测bcl-2和PCNA；HE染色中作核分裂像计数，并将后两者合并为增殖指数；用原位末端标记法(ISEL法)显示44例鼻咽癌及15例癌旁组织中的细胞凋亡。结果　①鼻咽癌PCNA、核分裂像数、凋亡细胞数均高于癌旁上皮组织，但与组织分型无关；增殖指数与凋亡细胞数呈正相关。②bcl-2在鼻咽癌中高表达，并与组织分型有关，与凋亡细胞数呈负相关。结论　①鼻咽癌肿瘤细胞具有高水平增殖的同时也具有高水平的凋亡，其肿瘤本身是高水平基础上增殖与凋亡失衡的结果。②bcl-2不是调控肿瘤细胞凋亡的唯一因素，但其抑制细胞凋亡的功能在鼻咽癌发病机制中有重要作用。

　　中图分类号　R739.63

　　文献标识码　A　文章编号　1000-1492(2000)02-0091-03

Correlation between apoptosis and proliferation in nasopharyngeal carcinoma

Li Hua, Meng Gang, Gong Xiyu et al

　　(Dept of Pathology, Anhui Medical University,Hefei　230032)

　　Abstract　Objective　To determine the correlation between proliferative and apoptotic indices and detect bcl-2 overexpression in nasophryngeal carcinoma. Methods　Immunohistologic staining for bcl-2,PCNA and mitotic counts were performed in archival material from 65 nasopharyngeal carcinomas and 15 normal nasopharyngeal epithelia. The PCNA and mitotic counts were combined into the proliferative indices (PIs). In addition, the apoptotic indices (AIs) were assessed by ISEL in 44 nasopharyngeal carcinomas and 15 normal nasopharyngeal epithelia. Results　①The proliferative indices and apoptotic indices of nasopharyngeal carcinomas were both significantly higher than those of nasopharyngeal epithelia, but not related to histologic classification. The high PIs were associated with the high AIs. ②bcl-2 was detected in the most nasopharyngeal carcinomas. bcl-2 overexpression was related to the histological classification, but negatively correlated with apoptotic indices. Conclusion　①The nasopharyngeal carcinoma has not only high cell growth rate, but also high cell death rate. The development of the tumors in the disturbance of the balance between the proliferation and the apoptosis. ②bcl-2 is not the only factor to regulate the apoptosis, but as an inhibitor of PCD,and it plays a role in the carcinogenesis of the nasopharyngeal carcinoma.

　　MeSH　nasopharyngeal neoplasms/pathology; proliferating cell nuclear antigen; apoptosis; genes,bcl-2

　　有关鼻咽癌中PCNA和bcl-2表达及肿瘤细胞凋亡等情况已有报道^〔1～4〕，但病例多集中于鼻咽癌高发地区，且缺少对增殖与凋亡间相互关系的研究。我省属鼻咽癌非高发区，它与高发区的发病率、病死率乃至组织类型均有差异^〔5〕。对我省鼻咽癌癌细胞增殖与凋亡关系及bcl-2表达情况进行综合性研究，将对完整揭示我国鼻咽癌发病机制有重要意义。

　　1　材料与方法

　　1.1　标本　随机收集安徽医科大学第一附属医院病理科1992～1993年间鼻咽癌病例档案蜡块65例(均未接受过抗肿瘤治疗)，按《中国常见肿瘤规范》(鼻咽癌)标准分型，结果为低分化鳞癌54例，高分化鳞癌9例，泡状核细胞癌2例。其中15例有癌旁组织。所有标本均为常规福尔马林固定，石蜡包埋。

　　1.2　试剂　PCNA(MAB-0145)、bcl-2(MAB-0014)及S-P法免疫组化试剂盒均购自福州迈新生物技术公司；PCD(凋亡)试剂盒购自洛阳华美生物技术公司；胰蛋白酶购自北京中山生物技术公司。

　　1.3　研究方法

　　1.3.1　免疫组化标记PCNA、bcl-2，按常规S-P法说明书进行，其中PCNA进行直接煮沸法抗原修复，bcl-2进行高压煮沸法抗原修复。

　　1.3.2　常规HE切片作核分裂像计数。

　　1.3.3　原位末端标记法(ISEL法)显示细胞凋亡。在PCD(凋亡)试剂盒说明书基础上加以改进。

　　1.4　阳性结果判断　PCNA阳性标准为染色位于细胞核，呈棕黄色颗粒。少数核分裂细胞可见弥散性胞浆着色。在高倍镜下观察1 000个肿瘤细胞，计数阳性细胞，以百分率表示，并根据以下标准划分等级及评分：Ⅰ级≤25%，计1分；Ⅱ级26%～50%，计2分；Ⅲ级，51%～75%，计3分；Ⅳ级，＞75%，计4分。核分裂像计数(MIs)在高倍镜下观察1 000个肿瘤细胞，计数核分裂像数，并根据以下标准划分等级及评分：Ⅰ级＜6个，计1分；Ⅱ级6～10个，计2分；Ⅲ级，11～15个，计3分；Ⅳ级，＞15个，计4分。将PCNA与核分裂像的评分相加，即为此病例的增殖指数(PIs)。ISEL法显示凋亡细胞的阳性标准为核呈棕黄色，背景清晰。在高倍镜下观察1 000个肿瘤细胞，计数凋亡细胞。bcl-2的阳性标准为不均匀胞膜及胞浆着色，根据阳性细胞比例及背景的对比程度，确定Ⅰ～Ⅳ4级，其中Ⅱ级以上视为bcl-2过表达。

　　1.5　统计学处理　率的比较用χ²检验或精确概率计算法检验。各检验指标在组织分型间的比较用Ridit分析。

　　2　结果

　　2.1　PCNA　PCNA阳性细胞的分布，在泡状核细胞癌和大多数低分化鳞癌中，较弥散，无明显规律性；在高分化鳞癌及部分低分化鳞癌中，则多位于癌巢周边部；癌旁组织中在鳞上皮分布无明确规律性，在柱状上皮及腺体多呈基底细胞着色。鼻咽癌各组织分型之间PCNA阳性细胞率经Ridit分析差异无显著性，癌旁组织PCNA阳性细胞率与鼻咽癌各组织分型差异有显著性(P＜0.02)。

　　2.2　核分裂像　核分裂细胞分布无规律性。在高分化鳞癌中，癌巢各层均可见到。鼻咽癌各组织分型之间核分裂像数经Ridit分析差异无显著性。癌旁组织核分裂像数与鼻咽癌各组织分型差异有显著性(P＜0.05)。

　　2.3　凋亡细胞计数　凋亡细胞呈散在分布，可见细胞互相分离、核浓缩或核呈棕黄色。鼻咽癌各组织分型之间凋亡细胞经Ridit分析无差异。癌旁上皮组织则未见凋亡细胞，与各组织分型之间差异有显著性(P＜0.05)。

　　2.4　PCNA、核分裂像数、增殖指数三者与凋亡细胞数的关系　核分裂像数、凋亡细胞数均以5/1 000(个)为界，划为两个等级。将PCNA与核分裂像数评分相加，即为每例的增殖指数。以增殖指数4分为界，划为两个等级。结果显示：PCNA与核分裂像数、凋亡细胞数，增殖指数与凋亡细胞数均有良好正相关性，即随着PCNA染色等级和增殖指数的上升，核分裂像数及凋亡细胞数也呈上升趋势，但核分裂像数与凋亡细胞数间差异无显著性。

　　2.5　bcl-2　在高分化鳞癌及部分低分化鳞癌中，可见整个癌巢大部分癌细胞着色。癌旁组织中，bcl-2阳性着色均集中于柱状上皮的基底层细胞，在腺体及鳞上皮则未见着色。bcl-2表达在鼻咽癌各组织分型间差异有显著性，阳性强度由高到低分别为泡状核细胞癌、低分化鳞癌及高分化鳞癌，癌旁上皮组织与鼻咽癌各组织分型间差异有显著性。

　　2.6　bcl-2表达与增殖指数、凋亡细胞数比较　结果显示bcl-2表达与凋亡细胞数呈负相关，即随着bcl-2表达增强，细胞凋亡水平下降，而bcl-2表达与增殖水平无相关性。

　　3　讨论

　　PCNA在核内的表达增加预示细胞进入S期或G₁晚期，即细胞已越过限速点，加强染色体复制及有关蛋白质的合成和磷酸化，为下一步进入M期做好物质准备^〔6〕；而核分裂像数则是有丝分裂期(M期)中细胞核形态的直接反映；作为细胞主动死亡的凋亡发生于G₁期^〔7〕。本研究65例鼻咽癌和15例癌旁上皮组织的结果表明，PCNA和核分裂像数呈良好正相关，证实两者可共同反映肿瘤细胞的增殖水平，故合并为增殖指数。代表增殖水平的指标在癌组织内高于癌旁上皮组织。同时本研究采用原位末端标记(ISEL)法显示凋亡细胞，结果显示44例鼻咽癌凋亡细胞数较15例癌旁上皮组织明显升高，由此可见鼻咽癌肿瘤细胞群体相对于癌旁上皮组织而言，其增殖水平明显升高。肿瘤首先是组织细胞过度增殖的结果，同时其凋亡速率也明显增加，是一个处于较高动力学水平的细胞群体，鼻咽癌肿瘤的发生是一个高水平基础上的细胞增殖和细胞凋亡失衡的结果。进一步研究发现，在鼻咽癌各组织分型间，PCNA、核分裂像数、增殖指数及凋亡细胞数差异均无显著性，提示：①鼻咽癌组织分型的差异不是细胞增殖水平差异的直接结果。②此结果与鼻咽癌高发区广东省的报道不一致^〔2〕，却与同为鼻咽癌低发区的沈阳市的报道相吻合^〔3〕，提示鼻咽癌肿瘤细胞的增殖、分化具有地域性差异，推测可能与各地不同的致癌因素及人群基因组差异有关。

　　bcl-2基因高表达可介导细胞凋亡障碍，使遗传物质突变率增加，从而参与肿瘤的发病过程^〔8～10〕。本研究中，45例鼻咽癌bcl-2过表达率较15例癌旁上皮组织明显升高，同时bcl-2基因表达与鼻咽癌凋亡细胞数呈负相关，表明bcl-2基因抑制细胞凋亡的生理功能在大多数鼻咽中得以保存，这种功能与鼻咽癌的发生、发展有重要关系。在鼻咽癌发病过程中，单独bcl-2并没有刺激细胞过度增殖的能力，但其可通过抑制有恶性转化倾向的细胞凋亡，协同C-myc和Ras等癌基因家族的成员，使细胞发生恶性转化，其激活表达应是继于其他基因变化，如p53突变，C-myc表达失衡等之后的一个早期分子事件，这一事件与鼻咽部细胞的恶性转化有关。本研究进一步显示bcl-2基因表达在鼻咽癌各组织分型间差异有显著性，说明bcl-2基因表达与鼻咽癌组织学分型有关，多在较幼稚、低分化的细胞中出现，而在高分化、较成熟或趋向凋亡的细胞中则下调，提示bcl-2参与了鼻咽癌肿瘤细胞在高增殖水平上的分化过程。

　　基金项目：安徽省教委科研基金课题(编号：97JL093)

　　作者简介：李　华，男，27岁，硕士

　　龚西騟，男，63岁，教授，硕士生导师

　　参考文献：

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1999-12-15收稿

　　2000-03-18修回