p16基因在鼻咽癌中缺失和表达改变的研究——p16基因在鼻咽癌中的改变系列研究(Ⅰ)

癌症 1999年第4期第18卷 快速报道

作者：卓缨　曹亚

单位：湖南医科大学肿瘤研究所分子生物室(长沙市，410078)

关键词：p16基因；表达下调；缺失

　　【摘要】目的：探讨p16基因是否在鼻咽癌活检组织中存在高频的失活，以确定该基因在鼻咽癌发病过程中所起的作用。方法：首先利用免疫组化的方法检测了14例鼻咽癌活检组织中p16基因的表达状况。并用比较多重PCR-Southern杂交的方法检测了这14例鼻咽癌活检组织中p16基因外显子1α和外显子2可能的缺失，以了解导致p16基因表达下调的机制。结果：在14例鼻咽癌活检组织中有12例(～85％)缺乏p16蛋白的表达，但其中只有2例鼻咽癌活检组织存在外显子2的缺失。结论：以上的数据显示p16基因在鼻咽癌中存在高频率的失活，提示该基因在鼻咽癌发病过程中具有一定的作用，同时，上述结果也提示p16基因的缺失并不是鼻咽癌中造成p16基因表达下调的主要原因。

　　中图分类号：R739.63R730.231；　　文献标识码：A　　文章编号：1000－467X(1999)04－0368－04

　　Down-expression and deletion of the p16 gene in nasopharyngeal carcinoma： Serial research on alterations of the p16 gene in nasopharyngeal carcinoma (Ⅰ)

ZHUO Ying，CAO YaCancer Research Institute of Hunan Medical University, Changsha 410078, P. r. China

　　【Abstract】Objectives： to investigate whether inactivation of the p16 gene is frequent in nasopharyngeal carcinoma (NPC) biopsies, and to determine that the p16 gene takes part in nasapharyngeal carcinogenesis.Methods： In the present study, the expression of p16 gene in 14 NPC biopsies was detected by immunohistochemistry, and the possible deletion of p16 gene exon 1α and exon 2 was also detected in these 14 NPC biopsies by comparative multiplex PCR-Southern blotting to understand the mechanism of p16 gene down-regulation.Results：It was found that 12/14 (～85％) NPC biopsies had no detectable p16 protein, but only 2/14 (～14％) biopsies showed deletion in exon. 2.Conclusion： these data suggests that the p16 gene is frequently inactivated in NPC and it may play a role in NPC carcinogenesis. It also suggests that there may be some other genetic alterations besides deletion accounting for the p16 gene down-regulation.

　　Key words：p16 gene;Down-regulation;Deletion

　　p16基因是定位于染色体9q21的一种周期素依赖性激酶抑制子(cyclin-dependent kinase inhibitor, CKI),它所编码的p16蛋白与CDK4或CDK6结合并抑制这两种酶的活性，从而导致细胞停滞在G1期。p16蛋白行使这一功能的区域为4个锚蛋白重复序列(ankyrin repeating sequences)^[1]。作为一种新的抑瘤基因，p16基因在多种肿瘤中存在高频率多种形式的改变。外显子2的纯合性缺失是最常见的p16基因失活的方式，而p16基因的突变则主要发生于编码4个锚蛋白重复序列的外显子1α和外显子2。另外，p16基因启动子和外显子1α内CpG岛的高度甲基化能阻断p16基因的表达^[2]。

　　鼻咽癌是我国南方及东南亚一带高发的恶性肿瘤。已有报道在鼻咽癌活检组织中存在高频率9p21-22区域的杂合性或纯合性缺失，并且在鼻咽癌细胞系和异体移植瘤中存在p16基因的表达下调^[3，4]。在本研究中，为了确定p16基因在鼻咽癌发病过程中可能的作用，我们对p16基因在鼻咽癌活检组织中的表达状况和缺失进行了进一步的研究。

　　1　材料与方法

　　1.1　材料

　　鼻咽癌活检组织及相应配对血标本14对由湘雅医院和湖南省肿瘤医院头颈科提供，所有患者均未经过化疗或放疗。鼻咽癌活检组织病理诊断均为低分化鳞癌。宫颈癌石蜡刀片3例由湖南省肿瘤医院病理科提供，病理诊断均为高～中分化鳞癌。

　　1.2　免疫组化

　　5μm厚的石蜡切片脱蜡入水后与1∶40稀释的兔抗人p16多克隆抗体p16c-20(美国SantaCruz公司)在4℃孵育过夜。再用ABC法进行检测。最后以苏木素复染。

　　1.3　比较多重PCR-Southern杂交

　　活检组织和配对血标本DNA的抽提按标准方法进行^[5]。比较多重PCR按以下程序进行：0.6μg基因组DNA，5μl缓冲液，200μmol dNTP, 30 pmol Txcol/co2, 30 pmol p16eol/eco2或p16 eo3/eo4(引物序列及扩增片段见表1)，在97℃变性5分钟，然后加入1μ1 taqDNA聚合酶(1.5 U/μl，华美公司)。扩增条件为：外显子1α，95℃50秒，56℃50秒，72℃50秒，24个循环。外显子2，95℃50秒，58℃50秒，72℃50秒，24个循环。反应产物用双蒸水1∶10稀释，凝胶电脉后转移至尼龙膜上分别与^[α-32P] dCTP(亚辉公司)标记的全长p16 cDNA探针和Tx探针进行杂交，其中Tx基因的扩增产物作为内对照。杂交后洗膜，放射自显影。杂交信号进行密度扫描。

表1　p16基因和内对照Tx基因PCR扩增引物序列表

　　2　结果2.1　鼻咽癌活检组织中p16基因表达的改变

　　我们首先利用免疫组化的方法检测了14例鼻咽癌活检组织中p16基因表达的改变。作为阳性对照的3例宫颈癌样本都显示明显的核阳性，即p16基因正常表达(图1a)。而在14例鼻咽癌活检组织中只有2例在癌细胞及作为内对照的癌旁上皮细胞内存在明显的核阳性(图1b)。在另外12例鼻咽癌活检组织中，只在癌旁上皮细胞中存在核阳性信号，鼻咽癌细胞中未见核阳性(图1c和1d)，这些数据显示这12例(～85％)鼻咽癌活检组织中p16蛋白的表达缺失。

图1　免疫组化检测鼻咽癌中p16蛋白的表达.

　　a).作为阳性对照的宫颈癌(×200)　b).无p16外显子2缺失的19号样本，在鼻咽癌细胞中有明显的核着色(如箭头所示，×400)。

　　c).有p16外显子2缺失的5号样本，只在癌旁上皮细胞中有明显的核阳性(如箭头所示)，但在鼻咽细胞中没有核着色(×400)。

　　d).无p16外显子2缺失的11号样本，与5号样本一样p16蛋白表达下调(×400)。

　　2.2　鼻咽癌中p16基因的缺失情况

　　为了进一步对引起p16基因表达改变的可能机制进行研究，利用比较多重PCR-Southern杂交的方法，对上述14例鼻咽癌活检组织中p16基因外显子1α和外显子2可能的缺失进行了检测。14例鼻咽癌活检组织中不存在p16外显子1α的缺失。图2显示所有的活检组织和配对血标本都有外显子1α和内对照Tx基因的扩增产物，且这些扩增产物的信号经密度扫描没有差别。

图2　比较多重PCR－Southern杂交检测p16基因外显子1α的缺失

　　a).比较多重PCR的凝胶电泳结果(B：配对外周血；T：肿瘤).b).PCR产物进行Southern杂交的结果。

　　14例鼻咽癌活检组织中有2例(～14％)存在p16基因外显子2的缺失。图3显示5号配对样本中，内对照Tx基因扩增产物的信号在鼻咽癌活检组织和配对血标本中均存在，但p16基因外显子2的扩增产物信号只在血标本中存在，在癌组织中没有，提示5号配对样本的癌组织中p16基因外显子2为纯合性缺失。而在4号配对样本中，同样内对照Tx基因扩增产物的信号在癌组织和配对血标本中均存在，且信号强弱无差别，但比较外显子2的信号强度，癌组织中的明显弱于血标本中的，提示在4号癌组织中也存在p16基因外显子2的缺失，可能由于癌旁非肿瘤组织的污染导致仍有少量扩增产物的产生。

图3　比较多重PCR－Southern杂交检测p16基因外显子2的缺失

　　a).比较多重PCR的凝胶电泳结果(B：配对外周血；T：肿瘤).b).PCR产物进行Southern杂交的结果，5号和4号样本存在缺失。

　　2.3　p16基因表达改变和p16基因外显子2缺失的关系

　　两者间关系如下：a.在4号和5号癌组织样本中检测到了p16基因外显子2的缺失，同时p16蛋白表达也缺失。b.在10例鼻咽癌活检组织中虽没有检测到p16基因外显子2的缺失，但p16蛋白表达缺失。c.在6号和19号鼻咽癌活检组织中p16基因外显子2无缺失，并且p16蛋白表达正常(见表2)。

　　N：正常：D缺失：＋：表达正常：－：表达下调；

表2　p16基因缺失与蛋白表达改变的关系

　　3　讨论　　p16基因是一个在多种肿瘤中失活的抑瘤基因。而抑瘤基因的失活最终常常表现为它所编码蛋白表达和结构的改变。因此，我们首先检测了鼻咽癌中p16基因表达的改变，从而确定p16基因在鼻咽癌活检组织中的改变频率。对于免疫组化结果的判断，我们参考了Geradts等人的报道^[6]。他同时利用免疫组化和Western杂交的方法检测了多种肿瘤中p16基因表达的改变。由于p16蛋白是定位于核内的抑瘤蛋白，因此，在实验中他发现只有用免疫组化的方法检测呈核阳性的样本，Western检测才有p16蛋白的存在，而仅仅是浆阳性的样本Western检测不到p16蛋白的表达。因此，他们推测只有核阳性才能显示p16蛋白的表达，而浆阳性是由于p16多克隆抗体非特异性染色造成的。根据他们的这一结果，在实验中我们认为核染色为特异性信号，而浆染色是非特异染色。实验中发现在14例鼻咽癌活检组织中有12例未检测到核阳性，即缺乏p16蛋白的表达，说明p16基因在鼻咽癌活检组织中失活的频率很高，很可能是在鼻咽癌发病过程中起一定作用的抑瘤基因。

　　p16基因表达调控的机制是非常复杂的。为了进一步了解导致p16基因表达高频率改变的机制，对上述14例鼻咽癌活检组织中p16基因外显子1α和外显子2的缺失情况进行了研究。考虑到加样误差和假阳性，我们采用比较多重PCR的方法进行检测，选择配对血标本作为正常对照，并以在鼻咽癌中尚无报道有缺失和突变的Tx基因的引物Txcol/co2作为内对照^[7，8]。另外，为了减少癌旁非肿瘤组织的污染，PCR扩增只进行24个循环，在达到平台期前结束。虽然纯合性缺失是p16基因最为常见的改变形式，但在14例鼻咽癌活检组织中只有2例存在外显子2的缺失，缺失率远远低于p16基因表达下调的频率，提示可能还存在其它的机制导致p16基因的表达下调。虽然先前的研究已证实在鼻咽癌中没有检测到p16基因编码区的突变，但非编码区的突变或小片段缺失也可能阻断p16基因的转录或缩短p16蛋白的半衰期。Shapiro等曾报道在非小细胞肺癌细胞系中由于p16基因第2个内含子剪接供体位点的突变导致p16蛋白半衰期明显缩短^[9]。p16基因启动子区域和外显子1αCpG岛的甲基化也可以阻断p16基因的转录。Lo等人曾在22％香港鼻咽癌患者中检测到p16基因的高度甲基化^[10]。另外EB病毒与鼻咽癌的发病有密切的关系，有报道它所编码的瘤蛋白EBNA-2和EBNA-LP能反式活化周期素D的表达，改变细胞周期的分布^[11]。p16蛋白的作用与周期素D相拮抗，是否EB病毒也会影响p16基因的表达是一个值得进一步探讨的问题。

　　要获得p16基因在鼻咽癌发病过程中起作用的直接证据。我们将通过基因转染的技术上调鼻咽癌细胞系中p16基因的表达，观察其对鼻咽癌细胞恶性表型逆转的作用来进一步证实。

　　致谢：感谢姚开泰教授和李桂源教授在本文完成过程中给予的支持和帮助。

　　[编者按：该系列研究(Ⅱ)将于本刊下期发表]

　　基金项目：国家杰出青年科学家基金(批准号：39525022)和中华医学基金(CMB)(批准号：90－529)资助。

　　参考文献

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　　10 Lo KW, Cheung ST, Leung SF, et al. Hypermethylation of the p16 gene in nasopharyngeal carcinoma [J]. Cancer Res,1996,56：2721～2725.

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收稿日期：1999－04－08；修回日期：1999－05－12