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显微切割鼻咽癌组织16号染色体杂合性缺失的研究

显微切割鼻咽癌组织16号染色体杂合性缺失的研究

癌症 2000年第1期第19卷 快速报道

作者：郭颖　方嬿　梁启万　李辉梅　郝亚萍　曾益新

单位：郭颖　方嬿　梁启万　李辉梅　郝亚萍　曾益新（中山医科大学肿瘤防治中心肿瘤研究所，广东广州510060）

关键词：鼻咽肿瘤；16号染色体；杂合性缺失

　　摘　要：目的：研究鼻咽癌中16号染色体的缺失情况。方法：采用显微切割的方法获取肿瘤组织，然后用PCR的方法以16号染色体上的8对引物对38例鼻咽癌进行分析。结果：38例鼻咽癌组织中所有标本至少有一个位点出现有杂合性缺失，其中D16S533出现杂合性缺失的频率最高，占86.1％(31/33)，此外，杂合性缺失频率超过50％的有引物D16S398、D16S390和D16S420，分别占78.8％(26/33)、69.4％(25/33)和57.6％(19/33)。结论：本研究首次发现在16号染色体上存在三个杂合性缺失高频缺失区，分别位于16p12.3(引物D16S420)、16q12.2(引物D16S390)和16q2122.1(引物D16S533，D16S398)。

　　分类号：R739.63　文献标识码：A

　　文章编号：1000－467X(2000)01－0001－05

Loss of heterozygosity analysis of micro-dissected nasopharyngeal

　　carcinoma tissues at chromosome 16

GUO Ying, FANG Yan, LIANG Qi-wan,et al.

　　Department of Etiology, Cancer Center, Sun Yat-sen University of

　　Medical Sciences, Guangzhou 510060,P.R. China

　　Abstract：Objective：To analyze the loss of heterozygosity (LOH) of chromosome 16 in nasopharyngeal carcinoma(NPC).Methods：Tumor tissues were obtained with microdissetion. PCR was used to analyse 38 NPC samples using eight primers on chromosome 16.Results：All of 38 cases were showed with LOH in at least one of the loci analyzed. Among these primers, D16S533 had the highest frequency of LOH, which was 86.1％ (31/33). High frequent LOH (＞50％ ) occured at three other loci including D16S398,D16S390 and D16S420,the presentages were 78.8％ (26/33), 69.4％ (25/33) and 57.6 (19/33), respectively.Conclusions： From this investigation, we found high frequent LOH occurred at chromosome 16p 12.3, 16q12.2 and 16q21-22.1 for the first time. These results indicate that more than one (TSGs) related to NPC may harbored at these regions.

　　Key words：Nasopharyngeal neoplasm; Chromosome 16; LOH ▲

　　鼻咽癌是我国及东南亚地区常见的恶性肿瘤之一，以往研究资料表明其发病与EB病毒感染、遗传因素和环境因素有关，迄今为止，对于鼻咽癌的发病机理至今仍未阐明。我们曾对47例鼻咽癌进行了比较基因组杂交的分析，简单概述了鼻咽癌基因组变化的全貌，染色体增加常见的有1q、3q、4、6q、8q、12和18号，其中3q21-26.2，4p12-q12，8p和12q14-15为扩增区。染色体缺失常见的有1p、3p、9q、11q、14、16和19p，其中16号染色体的缺失较明显，缺失频率为55.5％(26/47)[1]。Hui也曾对20例鼻咽癌进行了比较基因组杂交的研究，结果也发现有16号染色体长臂的缺失，缺失频率为40％[2]。由此可见，16号染色体的异常很有可能与鼻咽癌的发生与发展相关。

　　显微切割技术的出现在很大程度上解决了鼻咽癌活检组织中正常组织污染的影响，大大提高阳性检出率。本研究利用该方法从38例病理蜡块组织中挑取肿瘤组织，选用16号染色体上的8对引物进行分析，以描绘出鼻咽癌在16号染色体上高频率缺失区，为进一步寻找相关抑癌基因提供研究资料。

　　1材料和方法

　　1.1检查材料

　　标本来源于中山医科大学肿瘤医院门诊鼻咽癌纤维镜的活检组织，所有的病例都是未经治疗并经病理诊断为低分化鳞状上皮癌。正常对照来自同一患者的外周血。

　　1.2方法

　　1.2.1显微切割：鼻咽癌活检组织经病理常规包埋后作连续切片6～10张，HE染色后于光学显微镜下观察，用针挑出切片上的肿瘤组织(如图1)置于裂解液中。

图1示标本50显微切割的结果

　　A.示未行显微切割的病理切片图.()将要切割的肿瘤组织;B.示己进行微切割的病理切片图，所切出的组织为肿瘤组织.

　　1.2.2DNA抽提：切割出的肿瘤组织悬浮在50μ1DNA裂解液(50mmol/LTrisHCl，1mmol/LEDTA，0.1％Tween20，200μg/ml蛋白酶K，pH=8.0)中，50℃消化过夜，得到DNA裂解液，然后95℃变性灭活蛋白酶K，取1～1.5μl进行PCR作微卫星序列分析。正常对照的DNA从患者的外周血中按常规方法抽提出来。

　　1.2.3微卫星序列分析：我们选择16号染色体上的8对引物进行分析，PCR反应体系：500～800ng基因组DNA，10pmol引物，0.2mmoldNTP，1×buffer，2UTaq酶，加水至总体积为25μl，PCR反应：95℃变性5分钟，94℃30秒，55℃30秒，72℃30秒，循环35次；72℃延长7分钟。6％聚丙烯酰胺凝胶电泳，15mA，10小时0.2％硝酸银染色，摄片观察，肿瘤的电泳带比正常对照减少超过50％以上的被认为是缺失，肿瘤的两条带都发生缺失的称纯合性缺失，肿瘤的两条带只缺失一条的称杂合性缺失。

　　2结果

　　本研究应用显微切割的方法挑取38例鼻咽癌标本中的肿瘤组织，选取位于16号染色体上的8对引物进行微卫星序列分析（详见表1）。每例组织至少有6对引物可以提供信息（详见表2）。38例鼻咽癌组织中所有标本至少有一个位点出现有杂合性缺失，其中D16S533出现杂合性缺失的频率最高，占86.1％(31/33)，其次为引物D16S398和D16S390，分别占72.2％(26/36)和69.4％(25/36)。16号染色体短臂上的D16S420出现杂合性缺失的频率也超过了50％，占57.6％(19/33)。在这8对引物中有4对引物出现纯合性缺失，其中D16S533和D16S398出现的频率最高，每对引物可见6个标本出现纯合性缺失，D16S420和D16S395分别有4例和2例标本出现纯合性缺失。（详见图2）

表1　示微卫星序列分析的引物

Name Location Primers PCR length
D16S420 16p12 AFM238xb2a(F)5'ATTTCCTGAGGTCTAAAGCACCC

　　AFM238xb2m(R)5'TTAAGGCCCAGTCCACACTAAAG

 179-210 bp
D16S261 16q12.1 Mfd24CA(F)5'AAGCTTGTATCTTTCTCAGG

　　Mfd24GT(R)5'ATCTACCTTGGCTGTCATTG

 88-100 bp
D16S390 16q12.2 16AC10F5F(F)5'GACAGCCTCAAATGAAATATAACAC

　　16AC10F5R(R)5'CTCTCAGCTAGGGTAGTTGTTTATA

 177-195 bp
D16S533 16q21 D16s533F(F)5'GGGTCATATTCCTGCTCATGGTCC

　　D16s533R(R)5'CTGTGTAGCTAGAATGCATGTACC

 199-215 bp
D16S398 16q22.1 446(F)5'CTTGCTCTTTCTAAACTCCA

　　672(R)5'GAAACCAAGTGGGTTAGGTC

 182-194 bp
D16S395 16q23.1-2 16AC33G11F(F)5'GCATTTAAGGCAAAATTGAACTC

　　16AC33G11R(R)5'TGCCTTGCACATGCCTGTTAATGG

 170 bp
D16S516 16q24.1 AFM350vd1m(R)5'GGTGCCATCCTGACAGA

　　AFM350vd1m(R)5'GGTGCCATCCTGACAGA

 131-149 bp
D16S413 16q24.3 AFM196xg1a(F)5'ACTCCAGCCCGATAA

　　AFM196xg1m(R)5'GGTCACAGGTGGGTTC

 98-122 bp

　　表2　38例鼻咽癌16号染色体杂合性缺失分析结果

420 261 390 533 398 395 516 413
5 ★ □ ★ □ ★ □ □ □
7 □ □ ★ ★ □ □ □ ■
8 □ ★ ★ ★ ★ □ - □
10 ★ □ ★ ★ ★ □ □ □
11 □ □ □ ★ ★ ★ ★ □
13 □ ★ ★ ★ ★ □ ★ □
16 ★ □ □ ■ □ □ □
18 □ □ ★ ■ ★ □ □ □
19 ★ □ ★ ★ □ □ □ ■
20 □ ★ ★ □ □ □ ★ □
21 ★ □ □ □ □ ■ □ □
22 □ □ - ★ □ □ □ □
25 ★ □ ★ - ★ □ □ □
26 □ - ★ ★ ★ □ □ □
28 ★ ★ ★ ★ ★ □ ★ □
30 ★ □ □ □ ★ □ □ □
35 □ ★ ★ ★ ★ ★ □ □
36 ★ □ ★ ★ ★ ★ □
40 ■ □ ★ ■ ■ ★ □ □
41 □ □ ★ ★ - ★ □ □
42 □ □ ★ ★ ★ □ □ □
43 ■ □ ★ ■ ■ ■ □ □
45 □ □ □ ★ □ □ □ □
46 □ □ □ ★ ★ □ □ ★
47 □ □ □ ★ ★ □ □ □
48 ★ ★ ★ ★ ★ □ □ □
50 □ □ □ □ □ □ □ □
52 ■ □ ★ ■ ■ ★ □ □
53 ★ □ ★ ★ ★ ★ ★ □
54 ★ □ ★ ★ □ □ □ □
56 - □ ★ ■ ★ ★ □ □
57 □ □ - ★ ■ ★ □ □
59 ★ □ ★ □ ★ □ □
60 ★ □ ★ ★ □ □ □ □
61 □ □ □ ★ - □ □ □
62 □ □ ★ ★ ★ ★ □ □
63 ★ □ □ ★ □ □ □ □
65 ■ □ □ ★ ★ □ □ □
LON% 57.6 □ 69.4 86.1 78.8 36.8 21.6 7.9

　　★代表杂合性缺失；－代表没有提供信息；□代表没有异常；■代表纯合性缺失

图2示鼻咽癌16号染色体微卫星序列分析结果，其中T为肿瘤组织，N为正常组织，

　　()示肿瘤组织发生LOH的部位，肿瘤组织其中一条或两条泳带的信号较正常对照明显减弱。

　　标本43、52示纯合性缺失，标本36、18、65示杂合性缺失。

　　3讨论

　　16号染色体所含的遗传物质占人类基因组的3％，包含了1500～3000个基因[3]，其中只有一小部分基因调节细胞的分化与增殖，而在这些基因中有可能包含与肿瘤发生相关的基因，已有研究资料表明，16号染色体长臂的缺失在乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、Wilms瘤、肝细胞癌和小儿脑部肿瘤中较常见[4～9]。40％的肝细胞癌发现有16号染色体的缺失，其中16q的缺失与大肿瘤有关，在Wilms瘤中出现16q缺失的病人的复发率和死亡率均比未见16q缺失的病人高，Alain[10]在对59例前列腺癌病人的16号染色体进行了微卫星序列分析，发现16q24.3(D16S520与D16S413之间)这个覆盖了4cM的区域的缺失较常见；Tony[11]"也检测出56％的前列腺癌在16q24.3区域有缺失；而且Michae[12]也用FISH的方法证实了50％的前列腺癌在16q24.3区域有缺失。对于乳腺癌的研究进行的更多，无论在散发的病例还是家族的病例，无论是DCIS还是肿瘤均发现有16q24.3的缺失，Aldaz曾报道16q24.3的缺失在DCIS中尤为突出，提示该区域的缺失可能在乳腺癌的早期形成中起作用。但到目前为止尚未见有关16号染色体的异常与鼻咽癌的发生相关的报道。在以往的研究中，我们用CGH方法对47例鼻咽癌病人的活检组织进行分析，结果发现有23例出现16号染色体短臂的缺失，26例有长臂的缺失。

　　本实验对38例鼻咽癌16号染色体杂合性缺失分析中发现位于16q12.1的D16S533出现杂合性缺失的频率最高，占86.1％(31/33)，其次为位于16q21的引物D16S398和16q22.2的D16S390，分别占72.2％(26/36)和69.4％(25/36)，提示本组鼻咽癌病人在染色体16q12.2和16q21-22.1两个区域上有明显杂合性缺失。16q12的缺失在肝癌中也有发现，并且该区域的缺失和肿瘤大小呈正相关[13]。16q22这一位点的缺失在乳腺癌、前列腺癌、肝癌、内分泌肿瘤和Wilms瘤的研究中也有发现[14～18]，Elo[14]研究发现16q22这个区域在前列腺癌中出现明显的LOH，且31％的LOH患者发现有转移；Driouch[17]在研究乳腺癌时发现16q22的LOH不仅在原发的病例中较明显，在转移的病例中所占的比例也较高；Kihana[18]对内分泌肿瘤进行研究表明16q22的LOH和预后有关，出现16q22杂合性缺失的病人预后较差。此外，在这个区域还克隆出了两个与肿瘤关系密切的基因：CTCF基因和Ecadherin基因。前者恰恰位于乳腺癌和前列腺癌16号染色体杂合性缺失的最小区域里[16]，与这两种肿瘤有着密切的关系；后者与卵巢癌、乳腺癌和内分泌肿瘤相关，Slagle在对HBV阳性的肝癌的研究中也发现有该基因的单拷贝缺失[19]。总之，上述这些资料提示在16q12.2和16q2122.1在两个区域可能存在一个或多个与肿瘤发生相关的抑癌基因。

　　此外，杂合性缺失频率超过50％的位点还有位于16p12.3区域的D16S420，LOH的频率为57.6％(19/33)，而且在这个区域也发现有4例标本出现纯合性缺失。就目前的研究资料而言尚未发现该区域在其它肿瘤中有缺失，只有在结直肠癌的核型分析中发现有16p12的重组易位[20]，而且具有该区域重组易位的病人的生存期相应较短。Kampmann[21]曾对26例实体瘤病人的外周血进行了脆性部位的研究，发现普通脆性部位16p12出现频率较高。上述研究结果是否提示了位于16p12区域的基因在该部位断裂时出现了异常，而它的异常又导致了肿瘤的形成？在本研究中我们发现该区域缺失的频率较高，占总异常的44.4％(8/18)。这一结果进一步支持了16p12在肿瘤的形成过程中可能起了作用，至于这一区域是否存在一抑癌基因，它的失活导致了肿瘤的发生尚需进一步研究。

　　本研究首次发现在16号染色体长臂上存在两个LOH的高频缺失区，分别位于16q12.2和16q2122.1，提示在这些区域上可能存在与NPC发生有关的抑癌基因。然而由于这两个区域太大，无法确定其中的基因，尚需进一步缩小这个区域，以便建立一个YAC文库，找出已知或克隆出未知的与NPC发生有关的抑癌基因。此外，16号染色体短臂也发现有一LOH的高频缺失区16p12.3，这个区域也可能存在与NPC发病相关的抑癌基因，但由于研究的例数太少，选取的引物少尚不能肯定。此外，本研究选用了显微切割的方法从肿瘤的病理切片中直接挑取肿瘤组织，大大减少了活检组织中的正常组织对实验结果的影响，有效地提高了PCR的敏感度，从而大幅度地降低了假阴性的出现，为肿瘤的分子遗传学研究提供了一个很有效的方法。

　　基金项目：本课题受1998年度国家杰出青年科学基金B类(39825511)、美国CMB基金、国家自然科学基金重大项目、广东省自然科学基金重大项目和中山医科大学“211工程”重点学科建设资助项目资助

　　*通讯作者：Tel：86－20－87775466

　　Fax：86－20－87754506

　　Email：yxzeng@gzsums.edu.cn

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收稿日期：1999－10－12
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