染色体3p14.2区域一个与鼻咽癌呈负相关EST的鉴定
癌症 2000年第2期第19卷 快速报道
作者：田芳 李友军 陈主初 何春梅 邓燕飞 袁建辉 段朝军
单位：田芳（湖南医科大学肿瘤研究所肿瘤细胞生物研究室,湖南 长沙 410078）；李友军（湖南医科大学肿瘤研究所肿瘤细胞生物研究室,湖南 长沙 410078）；陈主初（湖南医科大学肿瘤研究所肿瘤细胞生物研究室,湖南 长沙 410078）；何春梅（湖南医科大学肿瘤研究所肿瘤细胞生物研究室,湖南 长沙 410078）；邓燕飞（湖南医科大学肿瘤研究所肿瘤细胞生物研究室,湖南 长沙 410078）；袁建辉（湖南医科大学肿瘤研究所肿瘤细胞生物研究室,湖南 长沙 410078）；
关键词：表达序列标记（EST）；鼻咽肿瘤；3p14.2；基因表达
【摘 要】目的：寻找染色体3p14.2区域与鼻咽癌相关的表达序列标记(expressed sequence tag,EST)，为筛选鼻咽癌候选基因打下基础。方法：运用生物信息学同源性比较筛选EST的策略,结合Northern杂交和逆转录PCR方法，检测3p14.2区域的相关ESTs在鼻咽癌和正常鼻咽组织中的表达。结果：在3p14.2区域筛选到一个在鼻咽癌中低表达的ESTw23312，与正常鼻咽上皮组织相比较，在鼻咽癌细胞株及13例鼻咽癌活检组织中的5例其表达下调（P＜0.01）。结论：染色体3p14.2区域ESTw23312在鼻咽癌中表达下调，提示其可能参与鼻咽癌癌变过程，为克隆鼻咽癌相关基因提供了新线索。
中图分类号：R739.63 文献标识码：A
文章编号：1000-467X（2000）02-0101-03
Identification of an EST down－regulated in nasopharyngeal carcinoma at chromosome 3p14.2
TIAN Fang LI You－jun CHEN Zhu－chu et al.
（Laboratory of Tumor Cell Biology, Cancer Research Institute, Hunan Medical University, Changsha 410078， P. R. China ）
【Abstract】 Objective: To identify the expressed sequence tags (EST) associated with nasopharyngeal carcinoma (NPC) at chromosome 3p14.2 for cloning of candidate gene(s) at the loci. Methods: Using ESTs homology analysis in bioinformatics combined with Northern blots and reverse transcription－PCR, the expression of relative ESTs at 3p14.2 was detected in nasopharyngeal carcinoma tissues in comparison with normal nasopharyngeal epithelia. Results: Comparing with expression of normal nasopharyngeal epithelia, EST w23312 was down－regulation in nasopharyngeal carcinoma cell line and five of thirteen nasopharyngeal biopsies（ P＜0.01） . Conclusion: W23312 is down－regulation in NPC. It may play a role in NPC carcinogenesis and provide a new clue in cloning of NPC associated gene(s).
Key words: Expressed sequence tag; Nasopharyngeal carcinoma; 3p14.2; Gene expression
鼻咽癌（nasopharygeal carcinoma,NPC）是一种上皮源性的恶性肿瘤，在华南地区、东南亚一带发病率较高。同许多其它肿瘤一样，NPC也是一个多基因多阶段作用的结果，涉及多种瘤基因、抑瘤基因的改变,如瘤基因c－myc、ras和bcl－2在NPC中过表达，而已知抑瘤基因p53、p16和pRb2在NPC发生发展中也可能起一定作用[1,2]。目前这种疾病的确切分子机制仍不很清楚。有研究显示NPC存在以下高频率杂合性丢失（loss of heterozygosity，LOH）位点：3p14－25、9p、11q等[3,4,5]，提示这些区域存在某种或某些未知的NPC相关基因，尤其是3p14.1－p14.3区域杂合性丢失高达50％～70％，提示该区域定位有与鼻咽癌密切相关的抑瘤基因。我们利用现存大量表达序列标记（expressed sequence tag，EST）资源，从NPC高频率LOH位点3p14区域的EST着手,应用Northern杂交和逆转录PCR（RT－PCR）方法，筛选、鉴定与鼻咽癌相关cDNA片段。
1 材料与方法
1.1 EST的筛选
我们从美国9家生物技术信息中心（NCBI）的EST数据库入手，首先在UniGene (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/index.html)中查找3号染色体的ESTs，有42,000多条ESTs需要筛选。为了缩小搜寻范围，靠近目标区域，又在EST数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/EST)中输入染色体区带信息，查找3p区域ESTs，找到几十条ESTs。利用GCG（Genetic Computer Groups,USA）的Seqlab软件包（又称Wisconcin Package）及基于Internet的数据库和分析系统对这几十条EST进行比较、分析，剔除代表已克隆基因的ESTs。选择的标准是：(1)与已知基因同源性约50％～85％，(2)EST长度至少在二百个碱基对以上，(3)代表未克隆基因，(4)尽可能来源于染色体3p14.2－14.3区域，(5)有关于染色体定位信息的说明；最后筛选到13个满足以上条件的ESTs。首先选取6个ESTs进行PCR扩增，回收送ABI377测序仪测序证实，再将它们做成探针，用于Northern blot筛选。
1.2 标本
人胚来自湖南医科大学附属第一、第二、第三医院产科水囊引产胚胎，胎龄20～28周，在无菌环境下分离人胚鼻咽上皮组织，原代培养，并去成纤维细胞。人胚胰腺、小肠、皮肤、肾、肺、心肌、大脑、气管、口颊粘膜均直接取材后立即冻存于液氮中。CNE2细胞株为一株成人鼻咽低分化鳞癌细胞株，由本所提供、培养。正常成人鼻咽上皮及鼻咽癌活检组织由湖南医科大学附属第二医院耳鼻喉科提供；正常成人鼻咽上皮病理活检为鼻咽慢性炎症改变（作为正常对照），鼻咽癌均为低分化鳞癌。标本取材后置液氮内速冻、保存。
1.3 总RNA提取
用TRIzolReagentTM试剂（购自Life Technologies公司）抽提原代培养人胚鼻咽上皮细胞和人胚胰腺、小肠、皮肤、肾、肺、口颊粘膜、气管、脑、心肌组织，CNE2细胞株及正常成人鼻咽上皮和鼻咽癌活检组织中的总RNA。活检组织先于液氮制冷下，在碾钵中将其碾碎，再加入TRIzol试剂，按说明书操作。
1.4 探针制备
PCR扩增合成ESTs探针，6％中性聚丙烯酰胺凝胶电泳回收纯化目标片段[6]，送PE公司ABI377测序仪测序证实。用PCR法以同位素α－P32－dATP标记探针。PCR反应条件：94℃变性，2分钟；循环程序：94℃30秒，68℃30秒，72℃45秒，30个循环；72℃,5分钟;4℃,保温。PE480机上进行。内对照β－actin探针（购自CLONTECH公司）用随机引物标记试剂盒（B.M.）以α－P32－dCTP标记，按说明书操作。
1.5 Northern杂交
RNA电泳按“分子克隆实验指南”[6]操作程序进行。转膜用BioRad公司785型真空转膜仪转膜2小时，压力5mmHg；80℃真空干烤2小时。65℃预杂交、杂交按“分子克隆实验指南”[6]操作程序进行。杂交液成分为5XDenharts,6XSSC,0.5％SDS,100μg/mlssDNA。洗膜：2XSSC，0.1％SDS，65℃15分钟洗膜2～3次，0.1XSSC，0.1％SDS15分钟洗膜1次。－70℃放射自显影24小时或36小时后洗片。同时用内对照β－actin探针杂交。
1.6 RT－PCR
提取26对鼻咽癌活检组织（NPC组）及正常成人鼻咽上皮（对照组）的总RNA，经DNaseI（BM公司）37℃消化痕量DNA，苯酚、氯仿抽提后再应用逆转录试剂盒（Promega公司）进行逆转录。尔后取逆转录产物5μl进行PCR反应，每管PCR中均同时加入内对照(GAPDH)引物和目标片段w23312引物，反应参数为94℃30秒，65℃30秒，72℃55秒，30个循环。30个循环为进入平台期前的循环数（数据未显示）。PCR产物点样于1.5％琼脂糖凝胶上，EB染色。电泳结果经GelDoc1000(Bio Rad公司)扫描分析仪通过光密度扫描计算曲线中各峰下面积及其比值。测定结果应用统计学软件SPSS中oneway ANOVA分析进行组间比较。
2 结果
探针测序证实与w23312一致。见图1。
图1 w23312探针测序图
w23312在多种人胚胎组织中的表达谱，各组织RNA量约为12～20μg。在胚口颊粘膜、胰腺、鼻咽、小肠、气管、皮肤、肾、心肌均有一约2.4kb杂交信号，在胚口颊粘膜、胰腺、鼻咽、心肌还有一约1.5kb杂交信号，可能是另一种转录本。胚肺、大脑未检测到杂交信号。见图2。
图2 w23312探针与多种人胚胎组织RNA杂交结果。
1:胚口颊粘膜2:胚胰腺3:胚鼻咽4:胚小肠5:胚气管
6:胚皮肤7:胚肾8:胚肺9:胚大脑10:胚心肌
Northern杂交结果显示w23312在鼻咽癌细胞株CNE2中表达明显下调，在人胚鼻咽上皮及正常成人鼻咽上皮表达较强，在鼻咽组织中存在2个大小分别约为2.4kb和1.5kb转录本。内对照β－肌动蛋白信号一致，表明各泳道RNA量一致。见图3。
图3左:人胚鼻咽上皮、正常成人鼻咽上皮、
CNE2与w23312探针Northern杂交信号。
右:同一张膜与β－肌动蛋白探针杂交信号
1：人胚鼻咽上皮细胞2：正常成人鼻咽上皮3：CNE2
RT－PCR琼脂糖凝胶EB染色后经GelDoc1000扫描、摄像，并运用分子分析软件（molecular analysis software，Bio Rad公司）通过光密度扫描计算曲线中各峰下面积及其比值。结果见图4及表1。如表1所示，两组间GAPDH表达无差异;与正常鼻咽组织相比较，NPC组ESTw23312表达水平明显降低，两组间峰下面积存在显著差异，有统计学意义。
图4 13对鼻咽癌活检标本及其正常鼻咽组织
RT－PCR结果
N:正常成人鼻咽组织T:鼻咽癌组织M:PCR marker(SABC)
表1 w23312在正常鼻咽上皮和鼻咽癌组织中
表达水平的比较（
±s）
| 组别 |
GAPDH(G) |
w23312(W) |
G/W |
| 正常鼻咽组 |
0.431±0.082 |
0.150±0.109 |
0.340±0.229 |
| 鼻咽癌组 |
0.385±0.112 |
0.042±0.018 |
0.114±0.050 |
| P值 |
＞0.05 |
＜0.01 |
＜0.01 |
3 讨论 鼻咽癌是一种基因－环境相关性疾病，而且为多基因多步骤改变。目前对NPC相关瘤基因和抑瘤基因进行了大量的研究，但基因改变在NPC发病机制中的意义没有取得突破性进展。有关肿瘤癌变原理，近年有学者提出“表达遗传学（express genetics）”的概念，认为由于突变引起肿瘤发生的基因仅占所有基因的2％，而大量的肿瘤相关基因是以表达激活或受阻的方式在肿瘤发生发展过程中起作用[7]。因此，相关基因的表达异常也可能是NPC发病的机制之一。人类基因组有约3×109个碱基对，基因约6～10万个。EST是cDNA的一部分，能够代表基因，因此利用现存大量EST资源，从EST入手可以快捷地找到与疾病相关基因。研究表明，3p14存在高频率的LOH，提示该区域很可能存在至少1个以上的抑瘤基因。我们利用鼻咽癌、胃癌、结肠癌细胞株，对近年克隆的位于3p14.2区域的候选抑瘤基因FHIT进行研究，发现其表达与NPC无明显关系。为寻找该区域可能的疾病基因，我们利用生物信息学资源筛选了6个位于3p14.2区域的ESTs进行Northern杂交，最终筛选出一个在鼻咽癌细胞中表达明显下调的ESTw23312，有文献报道此EST在小细胞肺癌细胞株中存在表达缺失[8]，这也是在染色体3p14.2区域发现的一个与NPC负相关的EST。
为进一步证实w23312与NPC的关系，采用差异RT－PCR扩增方法，结果在13例鼻咽癌活检组织中发现5例（38.46％）明显表达下调，13例癌标本及其正常鼻咽对照统计学分析有意义,P＜0.01，说明w23312在鼻咽癌中存在表达下调。这提示w23312在鼻咽癌癌变过程中可能起一定作用。研究还发现此EST在多种胚胎组织表达，其在胚口颊粘膜、胰腺、鼻咽、心肌均存在大小分别约为2.4kb和1.5kb二种转录本，而且在胚胎和成人鼻咽表达量一致，很可能代表较保守基因。目前我们正在进行其全长cDNA的克隆及功能研究。
[编辑:钟均行;校对:甘可建]
基金项目：本课题受卫生部课题基金(96－1－131)及国家医学遗传学重点实验室开放课题基金资助
段朝军（湖南医科大学肿瘤研究所肿瘤细胞生物研究室,湖南 长沙 410078）
通讯作者：陈主初：Tel：86－731－4474411－2990
Fax：86－731－4485482
E－mail：tcbl@public.cs.hn.cn
[参考文献]
[1] Lo KW, Cheung ST, Leung SF, et al. Hypermethylation of the p16 gene in nasopharyngeal carcinoma [J]. Cancer Res, 1996,56:2721～2725.
[2] Sheu LF, Chen A, Tseng HH, et al. Assessment of p53 expression in nasopharyngeal carcinoma [J]. Hum Pathol, 1995, 26:380～386.
[3] Huang DP, Lo KW, van Hasselt CA, et al. A region of homozygous deletion on chromosome 9p21－22 in primary nasopharyngeal carcinoma [J]. Cancer Res,1994,54:4003～4006.
[4] Lo KW, Tsao SW, Leung SF, et al. Detailed deletion mapping on the short arm of chromosome 3 in nasopharyngeal carcinomas [J]. Intern J Oncol, 1994,4:1359～1364.
[5] Hui AB, Lo KW, Leung SF, et al. Loss of heterozygosity on the long arm of chromosome 11 in nasopharyngeal carcinoma [J]. Cancer Res, 1996,56:3225～3229.
[6] J.萨姆布鲁克，E.F.弗里奇，T.曼尼阿蒂斯,等,著.金冬雁，黎孟枫，林枫,等,译.分子克隆实验指南[M].第二版.北京：科学出版社，1992:332～333.
[7] 陈竺,李伟，俞曼,等. 人类基因组计划的机遇与挑战：I从结构基因组学到功能基因组学[J].生命的化学,1998,18：5～13.
[8] Lux A, Bardenheuer W, Michael D, et al. Identification of novel expressed sequence tags' within the FHIT gene locus in human chromosome region 3p14.2 [J]. Hum Genet, 1997, 100: 90～95.
收稿日期：1999-11-15；修回日期：1999-12-10
用户登录 
新用户注册