博安霉素诱导人鼻咽癌细胞凋亡作用

癌症 2000年第4期第19卷 快速报道

作者：关中　叶辉　杨小平　丁健慧　梁永钜　龚坚

单位：关中　叶辉　丁健慧　龚坚（中山医科大学孙逸仙纪念医院耳鼻喉科,广东　广州　510120）；梁永钜　杨小平（中山医科大学肿瘤研究所，广东　广州　510060）

关键词：博安霉素；鼻咽肿瘤；凋亡

　　【摘要】目的：探讨博安霉素（博莱霉素A6）抗人鼻咽癌作用的机理。方法：应用荧光显微镜、流式细胞仪及琼脂糖凝胶电泳等方法检测博安霉素诱导人鼻咽癌SUNE-1细胞凋亡的作用。结果：当博安霉素浓度为50μg/ml，作用于SUNE-1细胞10小时，荧光显微镜下SUNE-1细胞出现明显的凋亡形态学改变；流式细胞仪出现亚G1峰，凋亡率为46.3％；琼脂糖凝胶电泳出现典型的DNA梯状条带。结论：博安霉素具有体外诱导鼻咽癌细胞凋亡的作用，而诱导凋亡为其抗肿瘤作用的机制之一。

　　中图分类号：R739.63　文献标识码：A　文章编号：1000－467X（2000）04－0293－03

Boanmycin induces apoptosis in human nasopharyngeal cancer cells

GUAN Zhong　YE Hui

　　（Sun Yat-sen Memorial Hospital, Sun Yat-sen University of Medical Sciences，

　　Guangzhou 510120,P.R.China.）

　　YANG Xiao-ping，et al.

　　（Cancer Institute, Sun Yat-sen University of Medical Sciences,Guangzhou 510080,P.R.China.）

　　【Abstract】 Objective: To investigate the antitumor mechanisms of boanmycin (bleomycin A6) on human nasopharyngeal cancer. Method: Apoptosis induced by boanmycin in human nasopharyngeal cancer SUNE-1 cells was tested by fluorescent microscope, flowcytometry and DNA gel electro phoresis. Result: When incubated with boanmycin (50 μ g/ml) for 10 hours, SUNE-1 cells showed morphological changes associated with the characters of apoptosis under fluorescent microscope. In flowcytometry analysis sub-G1 peak appeared in DNA frequency distribution histograms. Typical DNA ladder was found during gel electrophoresis. Conclusion: Boanmycin induces apoptosis in SUNE-1 cells in vitro, which may be one of its antitumor mechanisms of action against nasopharyngeal cancer.

　　Key words: Boanmycin; Nasopharyngeal neoplasms; Apoptosis

　　博安霉素（博莱霉素A6，争光霉素A6）是博莱霉素A6单一组分制品^[1]，为我国研制的一类新药，已完成Ⅱ期临床试验，认为该药对恶性淋巴瘤、头颈部癌、乳腺癌、食管癌等有效，且其肺毒性低，安全性较好^[2]。已有报道博安霉素对人肝癌（BEL-7402）^[3]、大肠癌体内、外均有明显的生长抑制作用^[4]，在体外对白血病细胞的杀伤作用很显著^[5]，我们的实验亦证实博安霉素具有体内外抗人鼻咽癌作用^[6]，但未见博安霉素诱导鼻咽癌细胞凋亡的报道，本文报道应用光镜、流式细胞仪及琼脂糖凝胶电泳进行博安霉素诱导人鼻咽癌SUNE-1细胞凋亡的研究。

　　1　材料与方法

　　1.1药物

　　博安霉素为白色粉末，由中国医学科学院医药生物技术研究所甄永苏教授惠赠；地塞米松（天心制药厂）。

　　1.2主要化学试剂

　　RPMI1640（Sigma公司），RNaseA（BoehringerMannheim公司），1KbDNAladder（Gibco公司），琼脂糖（Sigma公司），蛋白酶K（BoehringerMannheim公司），碘化丙啶（PI）（Sigma公司），Hoechst33258（Sigma公司）

　　1.3癌细胞系

　　SUNE-1为鼻咽低分化鳞状上皮癌细胞，由中山医科大学肿瘤研究所于1992年建株^[7]。细胞置于RPMI1640培养液（含10％小牛血清、青霉素100u/ml、链霉素100μg）中培养。

　　1.4荧光显微镜观察法

　　取对数生长期SUNE-1细胞，胰酶消化，制成1×10⁶个细胞悬液，种植于25ml的培养瓶中（3ml/瓶），加入博安霉素使终浓度为50μg/ml，对照组加等体积生理盐水。培养10小时，胰酶消化，离心，再制成单细胞悬液，涂片，晾干后用甲醇：冰醋酸固定液固定，Hoechst33258染色，干燥后封片，荧光显微镜下观察细胞形态，照片。

图1荧光显微镜下博安霉素处理SUNE－1细胞的形态变化(×100)

A:博安霉素50μg/ml处理10小时后的细胞;B:对照组细胞

图2博安霉素诱导SUNE-1细胞凋亡的琼脂糖凝胶电泳分析图1.1KbDNAladder;2、5.阳性对照组;3.博安霉素组（50μg/ml，10小时）;4.阴性对照组

　　1.5琼脂糖凝胶电泳法

　　如1.4所述处理及收集细胞，阳性对照取4周龄昆明鼠胸腺，制成细胞浓度为1×10⁶个/ml的单细胞悬液，取3ml种植于25ml培养瓶中，加入地塞米松，使终浓度为1×10^-5mol/L于37℃，5％CO₂孵箱中培养6小时后收集细胞，参照文献方法进行DNA提取及电泳^[8]。

　　1.6流式细胞仪观察法

　　如1.5所述处理及收集细胞，胰酶消化，1500r/min离心5分钟，沉淀加入PBS液1ml，制成单细胞悬液，再加入70％乙醇3ml固定，20℃保存。染色前用PBS液进行离心沉淀，去除固定液，加200μlRNaseA37℃水浴30分钟，再加入800μlPI染色液混匀，置4℃避光染色30分钟，流式细胞仪（COULTERELITE）上测试，记录激发波长488nm红色荧光。

　　2　结果

　　2.1荧光显微镜观察法

　　用50μg/ml博安霉素处理SUNE-1细胞10小时，荧光显微镜下观察到凋亡细胞核或细胞质内可见浓染致密的颗粒状黄绿色荧光，肿瘤细胞出现明显缩小、细胞膜完整、核染色质浓缩、靠核膜周边聚集等典型的凋亡细胞形态学改变，而正常细胞核呈弥漫均匀荧光，荧光较弱。见图1。

　　2.2琼脂糖凝胶电泳法

　　当药物浓度为50μg/ml，作用于SUNE-1细胞10小时，加药组及阳性对照组凝胶电泳出现典型的DNA梯状条带（DNAladder），而阴性对照组不出现梯状条带。见图2。

　　2.3流式细胞仪观察法

　　在博安霉素浓度为50μg/ml时，SUNE-1细胞DNA直方图上加药组培养10小时出现明显亚G1峰，即凋亡峰，凋亡率为46.3％，而对照组细胞DNA直方图上不出现亚G1峰，凋亡率仅为3.3％。结果见图3。

图3博安霉素诱导SUNE－1细胞凋亡的流式细胞仪分析图

　　A:博安霉素组（50μg/ml，10小时）;B:对照组。AP凋亡细胞

　　3　讨论

　　鼻咽癌是我国南方常见的恶性肿瘤，其病理类型以低分化鳞癌及未分化癌为主，目前主要治疗手段为放疗，但对于转移的亚临床病灶及复发的病例，仍然需要其它手段治疗。自70年代以来，随着控制鳞状细胞癌的高效药物相继问世，化疗在鼻咽癌治疗中的地位日益受到重视，而新药的开发及应用对化疗的作用显得十分关键。

　　博安霉素是一种新型的博莱霉素类抗肿瘤抗生素，我们的研究已经证实博安霉素在体外对人鼻咽癌SUNE-1具有明显的杀伤作用，细胞接触药物72小时，IC50为1.45μg/ml。在可耐受的剂量下，博安霉素对裸鼠移植的鼻咽癌SUNT-1具有明显的生长抑制作用，抑瘤率分别为84.3％(10mg/kg)及88.9％（15mg/kg）。在此基础上，我们进一步探讨博安霉素潜在的抗肿瘤作用机制。

　　博安霉素与其他博莱霉素类抗生素已知的作用机制是由于它与Fe的复合物嵌入DNA，最终导致超氧或羟自由基的生成使DNA断裂。有报道认为，一定浓度平阳霉素作用一定时间可诱导食管癌细胞株EC8712发生凋亡^[9]。而近年来有关博莱霉素作用机理的研究表明，博莱霉素各组分的作用机制可能存在差异^[10]，已证明许多抗肿瘤药物可以通过诱导肿瘤细胞凋亡发挥作用^[11]。本实验应用荧光显微镜、流式细胞仪及琼脂糖凝胶电泳等方法证明博安霉素具有诱导鼻咽癌细胞凋亡的作用^[12,13]。细胞的凋亡在肿瘤的治疗中有着重要的意义，许多肿瘤促进剂能明显抑制肿瘤细胞凋亡，凋亡抑制使细胞生长及死亡失平衡而导致肿瘤产生、发展；而多种抗肿瘤药物具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用，通过诱导肿瘤细胞凋亡发挥其抗肿瘤作用。癌基因及抑瘤基因如p53、p21、bcl-2等直接参与细胞凋亡的调控。由于已证实博安霉素具有体内外抗人鼻咽癌作用，并可诱导鼻咽癌细胞凋亡，因此，认为诱导凋亡是博安霉素抗肿瘤作用的机制之一。(本文由甄永苏院士推荐)

　　通讯作者：关中　Tel:86－20－81332580

　　[参考文献]

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收稿日期：2000－01－05

　　修回日期：2000－02－23