鼻咽癌癌前及其高危人群鼻咽上皮组织EB病毒DNA酶基因检测

中华肿瘤杂志 1998年第4期第0卷 基础研究

作者：黄必军　黄迪　吴秋良

单位：510060 广州，中山医科大学肿瘤防治中心肿瘤医院 肿瘤研究所病因室(黄必军、黄迪)，病理科(吴秋良)

　　关键词： 鼻咽肿瘤；癌前状态；爱泼斯坦-巴尔病毒；基因，病毒；聚合酶链反应

　　【摘要】　目的　探讨非癌鼻咽上皮细胞发展为鼻咽癌(NPC)的过程中，EB病毒在什么阶段进入鼻咽上皮。方法　利用广州中山医科大学肿瘤防治中心四会县防癌基地1994年度复查工作及肿瘤医院门诊，收集鼻咽癌及各类“癌前状态”及“癌前病变”患者蜡块450余例，应用改进后的多聚酶链反应(PCR)方法进行EBV-DNA酶基因片段扩增检测。结果　NPC浸润癌组织EBV-DNA酶基因片段扩增阳性率为97.3%(145/149)，NPC原位癌4例中，基因阳性者2例，而防癌基地“癌前状态”人群155例中阳性者2例，阳性率为1.3%(2/155)。临床癌前病变组阳性率为零(0/47)。结论　EB病毒在非癌鼻咽组织中出现频率十分低，EB病毒可能在鼻咽上皮癌变后才进入鼻咽上皮，提示EB病毒可能不是NPC的病因。

　　The examination of EBV-DNase gene fragment in the paraffin embedded NPC, pre-cancerous and high risk population nasopharyngeal tissues　　Huang Bijun, Huang Di, Wu Qiuliang. Cancer Institute, Sun Yet-sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510060

　　【Abstract】　Objective　To examine if EB virus enters nasopharyngeal epithelial cells in the course of the tumorigenesis in nasopharyngeal carcinoma (NPC).Methods　Based on the annual investigation of Si-Hui county, a cancer-prevention base of the Sun Yet-sen University of Medical Sciences and Tumour Hospital out-patient clinic, more than 450 paraffin-embedded tissues with NPC, and with pre-cancerous lesions in high risk populations were collected for the detection of EBV-DNase gene fragment by an optimized PCR method.Results　In 145 of the 149(97.3%) cases with invasive NPC, and 2 of 4 cases with in situ NPC, EBV-DNase gene was detected. However, in Sihui, Canton, a high-risk county for NPC, only 2 of the 155 subjects with nasopharyngeal precancerous state was the gene positive, and none of the 47 cases examined in the out-patient department of the Tumor Hospital with precancerous lesions in the nasopharynx was positive.Conclusion　EBV is seldomly detected in the non-malignant and precancerous lesions in the nasopharynx in high-risk populations. It implies that EBV is probably not etiologically involved in the genesis of NPC.

　　【Subject words】　Nasopharyngeal neoplasms　　Precancerous conditions　　Epstein-Barr virusGenes, viral　　Polymerase chain reaction

　　鼻咽癌(NPC)有一个相当长的癌前阶段，包括癌前状态和癌前病变^［1～3］。为了探讨Epstein-Barr病毒(EBV)究竟在什么“癌前状态”进入鼻咽上皮，我们于1994年在中山医科大学肿瘤防治中心防癌基地“八五”攻关研究课题年度复查时，收集处于各种NPC“癌前状态”活检组织155例，用新合成的引物及改进的方法^［4］进行EBV-DNA酶基因多聚酶链反应(PCR)扩增检测，并测序以确定特异性。

材料与方法

　　一、细胞和组织

　　EBV阳性细胞株B95-8、EBV阴性细胞株K562均取自广州中山医科大学肿瘤研究所保存细胞株。NPC石蜡包埋组织标本及NPC、“高危人群”^［4］鼻咽组织石蜡包埋标本均取自中山医科大学肿瘤医院病理科。

　　二、PCR及产物DNA序列分析

　　1.引物：我们根据gene bank基因库VO1 555，BG LF5读码框，EBV-DNA酶基因序列设计，产物为408bp，为全基因的29%。由海南医学院蛋白质及核酸研究室合成，其序列为：引物Ⅰ 5′＞CTGATGTGG- GACATATTGCG＜3′；引物Ⅱ 5′＞CCTCTTGTAAAG- CGCAGTGT＜3′。

　　2.PCR扩增EBV-DNase基因：石蜡包埋组织切片经二甲苯脱蜡，乙醇洗涤、脱水。加裂解缓冲液100 μl(蛋白酶K浓度为100 μg/ml)置于56℃水浴轻摇过夜，并于98℃ 10分钟灭活蛋白酶K，离心上清作为PCR扩增模板。扩增条件为94℃ 5分钟变性，94℃ 45秒、55℃ 45秒、72℃ 1分钟，30个循环，72℃延伸7分钟。凝胶电泳紫外分析扩增产物。

　　3.DNA序列分析：用Biorad公司PCR扩增DNA片段纯化试剂盒纯化PCR产物。序列分析采用EBV-DNA酶基因负链(引物Ⅰ)，试剂为PE公司DNA测序试剂盒；仪器为PE公司377型DNA序列分析仪。

结果

　　1.EBV-DNA酶基因检测：B95-8及NPC组织扩增产物为408 bp，而K 562细胞株及高危人群鼻咽组织则不能扩增出此片段(附图)。PCR扩增产物的DNA序列分析结果显示，基因碱基编码序列与gene bank VO1555中BGLF5读码框的相关序列完全相符。

1：分子量对照；2：B95-8细胞株；3：K562细胞株；

　　4，5，7，8，10，11：NPC组织；6，9：高危人群鼻咽组织

　　附图　EBV-DNA酶基因PCR结果

　　2.鼻咽癌及高危人群鼻咽组织EBV-DNA酶基因PCR检测：经病理确诊的鼻咽癌患者及高危人群鼻咽组织EBV-DNA酶基因PCR检测结果见表1。

　　3.癌前病变各阶段病例中EBV-DNA酶基因检

表1　鼻咽癌及高危人群鼻咽组织EBV-DNA酶基因扩增结果

　　注：鼻咽浸润癌与高危人群比较，χ²=303, P＜0.0005，差异有显著性

测：我们收集了临床癌前病变鼻咽组织47例，其中轻、中、重不典型增生分别为24例、14例和9例，无一例发现有EBV-DNA酶基因。同时，收集防癌基地癌前病变鼻咽组织34例，其中轻、中、重不典型增生分别为27例、6例和1例，仅在27例不典型增生中发现2例有EBV-DNA酶基因。临床与现场癌前病变鼻咽组织中，EBV-DNA酶基因阳性率为2.5%(2/81)，且3种不同阶段癌前组织中的EBV-DNA酶基因阳性率差异无显著性(P＞0.05)。

　　4.EBV-DNA酶基因与NPC抗体之间的关系：我们将具有下列血清学情况者列为癌前状态^［3］：(1)EB病毒VCA/IgA＞1∶80者；(2)EB病毒DNA酶抗体(EDAb)＞60%者；(3)EB病毒VCA/IgA＞1∶5，EA/IgA＞1∶5, EDAb≥30% 3项中任何2项或3项阳性者；(4)VCA/IgA、EA/IgA及EDAb 3项中任何一项持续上升者。癌前状态或癌前病变者被视为鼻咽癌高风险人群。防癌基地不同血清学阳性“癌前病变”组EBV-DNA酶基因检出情况见表2。

表2　防癌基地各种“癌前病变”人群鼻咽组织EBV-DNA酶基因扩增结果

　　注：各组阳性率两两比较，差异均无显著性，P＞0.05

讨论

　　研究结果表明，EBV与NPC密切相关，但其病因学至今仍未得到确定。我们旨在确定，在不同时期的鼻咽上皮EBV出现频率，从而进一步探讨EBV可能出现的阶段。本研究实验结果显示，EBV-DNA酶基因在鼻咽癌组织中出现频率很高，而在“高危人群”的非癌鼻咽上皮中却非常低。这些实验结果提示了在鼻咽上皮细胞癌变过程中，EBV-DNA酶基因出现在细胞中的现象非常罕见。

　　本组155例“高危人群”，是在约40 000名自然人群中，主要根据血清学结果筛选出来的，其中20 000多人已追踪了6年(1987年开始)。从“癌前病变”及“癌前状态”人群扩增结果分析，基本上无明显差别，进一步说明非癌鼻咽上皮细胞在癌变过程中出现EBV-DNA酶基因是非常罕见的事实。至于4例鼻咽原位癌EBV-DNA酶基因阳性者2例，可能与活检组织体积小、组织中癌细胞少有关。特别是标本经过光镜检查切去几片后，很可能便将有癌细胞的部分切掉。Yeung等^［5］也报道了类似的结果，在6例鼻咽原位癌EBV基因片段阳性者只有3例。

　　近年来，Sam等^［6］报道高危人群鼻咽上皮细胞中EBV基因片段的出现，由于他们标本例数不多，并局限于有明显症状的NPC可疑患者，由此所获结果，总体上难免有存疑的地方。本组所用主要标本均来自我校防癌基地的自然人群，例数高达155例，PCR的灵敏度高，尤其是本研究扩增产物特异性经过序列分析证明；加上本组按蜡块保存期研究结果选取标本，排除了蜡块标本失效的可能性。因而，研究方法可靠、灵敏度高及特异性强，对EBV在鼻咽上皮细胞发展为NPC哪一“阶段”或哪种“状态”中出现的问题，提供了明确可靠的资料。对NPC的病因发病学、鉴别诊断学及其他可能与EBV有关的慢性及恶性疾病的研究均有参考价值。

　　本课题受国家八五攻关基金资助

参考文献

　　1蔡海英，李博山，陈倪勇，等. 鼻腔鼻咽的癌前期模型与维甲酰胺阻断癌变的实验研究. 癌症，1985，4：199-202.

　　2Feng BC, Liu KL. A morphological study of stromal microvasculature of nasopharyngeal precancerous lesions. Chinese Med J, 1991, 104: 422-425.

　　3黄腾波，汪慧民，李景廉，等. 鼻咽癌高危人群癌前病变的确立. 癌症，1997，12：81-83.

　　4朱振宇，黄迪，马涧泉. EB病毒特异性基因片段扩增在鼻咽癌诊断及鉴别诊断中的初步应用. 中华肿瘤杂志，1995，17(增刊)：27-29.

　　5Yeung WM, Zong YS, Chiu CT, et al. Epstein-Barr virus carriage by nasopharyngeal carcinoma in situ. Int J Cancer, 1993,53: 746-749.

　　6Sam CK, Beook LA, Niedobiter G, et al. Analysis of Epstein-Barr virus infection in nasopharyngeal biopsy from a group at high risk of nasopharyngeal carcinoma. Int Cancer, 1993, 53: 957-959.

(收稿：1997-11-20　　修回：1998-03-06)