鼻咽癌染色体9p21～22区域精细缺失图谱的构建

中华肿瘤杂志 1999年第6期第21卷 基础研究

作者：阳剑波　唐湘娜　邓龙文　谭国林　周鸣　曾朝阳　曹莉　李桂源

单位：410078 长沙，湖南医科大学肿瘤研究所

　　关键词： 鼻咽肿瘤；染色体9p21～22；杂合性丢失；肿瘤抑制基因

　　【摘要】　目的　进一步精细限定鼻咽癌9p21～22区域等位基因杂合性丢失的频率和范围，为发现和分离克隆该区域内的鼻咽癌抑瘤基因提供新线索和依据。方法　应用11个定位于9p21～22区域的高密度微卫星位点，检测25例低分化鼻咽癌患者的杂合性丢失。结果　25例患者中，有17例存在一个或多个位点的杂合性丢失，占68.0%。其中D9S161(35.0%)、D9S1678(31.6%)、D9S263(33.3%)和D9S1853(33.3%)4个紧邻位点的丢失频率相对较高，并发现有6例患者在这些位点表现为连续性缺失。结论　鼻咽癌染色体9p21～22区域D9S161～D9S1853位点之间(2.7 cM)是鼻咽癌患者的一个较小共同缺失区，该区域内的抑瘤基因失活可能是鼻咽癌发生发展过程中的重要事件。

Detailed deletion mapping of chromosome 9p21～22 in nasopharyngeal carcinoma

YANG Jianbo, TANG Xiangna, DENG Longwen, et al. Cancer Research Institute, Hunan Medical University, Changsha 410078

　　【Abstract】　Objective　To further refine the extent of deletion on chromosome 9p21～22 in nasopharyneal carcinoma(NPC) and provide evidence for discovering new tumor suppressor genes.Methods　Loss of heterozygosity (LOH) on chromosome 9p21～22 was analyzed in 25 paired blood and tumor samples by using 11 high-density microsatellite polymorphic markers.Results　Of the 25 cases, 17(68.0%) showed LOH at one or more loci. Higher frequencies of LOH were found at four loci: D9S161(35.0%), D9S1678(31.6%), D9S263(33.3%) and D9S1853(33.3%). In 6 cases, contiguous stretch of allelic loss was found.Conclusion　The minimal common region of deletion might be defined between D9S161 and D9S1853 (approximately 2.7 cM in length) at 9p21.1, suggesting that inactivation of one or more tumor suppressor genes located in this region may be an important step in NPC.

　　【Subject words】　Nasopharyneal neoplasms　　Chromosome 9p21～22　　Loss of heterozygosity　　Tumor suppressor gene

　　有研究表明，鼻咽癌的发生与EB病毒感染、环境因素和遗传因素有关。中国南方及东南亚地区的发病率比欧洲等地的发病率高25倍以上，鼻咽癌的种族聚集性特点及10%～15%的家族聚集史提示，鼻咽癌的发生可能与其易感基因有关。但目前为止，还未发现与鼻咽癌密切相关的易感基因或抑瘤基因。近年来的研究表明，9p21～22区域的等位基因杂合性丢失(loss of heterozygosity，LOH)现象是鼻咽癌等多种肿瘤中的共同事件，提示该区域内存在一个或多个与肿瘤发生密切相关的抑瘤基因^［1-3］。p16/MTS-1基因被定位于9p21区域，认为是多种肿瘤在该区域内抑瘤基因的主要候选者^［4-6］。要证实或发现9p21～22区域鼻咽癌相关抑瘤基因，还需进一步精细限定鼻咽癌患者在9p21～22区域内的LOH频率及范围。因此，我们应用11个定位于9p21～22区域的高密度微卫星多态性标记，对25例低分化鼻咽癌患者进行了LOH分析。

　　材料与方法

　　1.标本：25例原发性鼻咽癌活检组织均来源于湖南医科大学湘雅医院及湖南医科大学附属第三医院未经放疗和化疗的确诊鼻咽癌患者，同时抽取其对应外周血为对照标本。所有癌标本病理检测证实均为低分化鳞癌，并根据TNM分期法进行临床分期。

　　2.LOH分析：按常规方法苯酚氯仿抽提癌组织及外周血DNA，稀释成100 ng/μl，4℃保存。查询Internet GenBank资料库，选择11对高密度覆盖9p21～22区域的微卫星多态性标记，其引物均购自Research genetics Inc。PCR 50 μl反应体系中含基因组DNA 200 ng；上、下游引物各0.2 μmol/L～0.3 μmol/L；dNTP 浓度为200 μmol/L；缓冲液为10 mmol/L Tris-HCl，50 mmol/L KCl，15 mmol/L MgCl₂；1.5～2.0 U Tag DNA聚合酶( 华美公司产品)。95℃变性5分钟，94℃50秒，52℃～58℃60秒，72℃60秒反应32个循环，72℃延长10分钟。取5～8 μl PCR产物，用甲酰胺变性示踪液稀释液1倍，95℃变性5分钟，上样于8%变性聚丙烯酰胺凝胶(含8 mol/L尿素)，550V电泳2～3小时分离后，在0.2% 硝酸银溶液染色15分钟，用1.5% NaOH和0.4%甲醛溶液显色至PCR产物带型清晰,干燥后保存。

　　3.LOH判定：当患者为某一微卫星多态性标记的杂合子时，相应外周血DNA的PCR扩增产物表现为两条等位基因片段，可提供信息用于LOH分析；若为纯合子则不能提供信息。与相应外周血DNA的PCR扩增条带比较，若肿瘤组织中某一等位基因条带消失或其中一条相对密度减少50%以上，则判定为LOH。判定为LOH的标本需重新进行PCR及电泳确定。

　　结果

　　25例鼻咽癌患者中，17例(68.0%)存在一个或多个位点的LOH，7例患者表现为不同程度的连续性LOH，11个微卫星位点的LOH频率见表1。其中位于9p21.1的D9S161位点丢失频率最高，为35.0%(7/20)；与该位点相邻的D9S1678、D9S263、D9S1853位点丢失频率均相对较高，为31.6%～33.3%；丢失频率最低的是位于9p13.1的D91874位点，为5.9%(1/17)。值得注意的是，与p16/MTS-1基因最近的位点D9S1870丢失频率并不高，为16.7%（3/18）。从11个微卫星位点缺失图谱(图1)分析，6位患者T-7，T-8、T-17、T-21、T-25和T-27在D9S161～D9S1853之间均存在连续性杂合性丢失。因此，D9S161～D91853 之间可能是鼻咽癌患者9p21～22区域的一个较小共同缺失区，遗传距离约为2.7 cM，距p16/MTS-1基因约14 cM。此外，应用SPSS/PC+40的GROSSTABS软件对鼻咽癌患者Ⅰ～Ⅱ期和Ⅲ～Ⅳ期与等位基因丢失的关系进行统计学分析，结果显示，肿瘤的局部病灶情况、颈部淋巴结转移及临床分期与这些位点的等位基因丢失无显著相关性(P＞0.05)。

表1　鼻咽癌染色体9p21～22区域的11个微卫星多态性

　　位点等位基因杂合性丢失频率

□：杂合子无丢失，■：杂合性丢失，N：没有信息

1　部分鼻咽癌患者染色体9P21～22区域的11个微卫星多态性位点等位基因杂合性丢失检测结果

　　讨论

　　较多研究表明，9p21～22 区域的高频LOH是多种肿瘤发生发展过程中的共同事件。乳腺癌 、膀胱癌、肺癌及黑色素瘤等肿瘤中，9p21～22区域的LOH频率为43%～57%^［1-3］；在头颈部癌中为81%^［7］。在鼻咽癌中，Huang等^［1］用21对微卫星多态性标记检测了9号染色体长臂和短臂等位基因缺失情况， 发现18例低分化鳞癌患者中有11 例(61%)存在LOH，其范围在9p23～9q21.1之间，并且发现1例患者在9p21～22区域的D9S162～D9S161位点之间(遗传距离约17 cM)存在纯合性缺失。我们检测了25例鼻咽癌患者9p21～22区域的LOH，其频率为68.0%(17/25)，丢失频率最高的是D9S161位点(35.0%，7/20)，其结果与Huang等的基本相符，但未发现有纯合性丢失现象。与Huang等的研究不同的是，我们采用高密度覆盖9p21～22区域的11个微卫星多态性标记(平均遗传距离约1.5 cM)，构建了9p21～22区域的精细杂合性缺失图谱，发现7例患者(T-7、T-8、T-12、T-17、T-21、T-25、T-27)在D9S162～D9S165之间表现为不同程度的连续性LOH，其中6例患者(T-7、T-8、T-17、T-21、T-25、T-27)在D9S161～D9S1853间同时存在杂合性丢失,且这些位点有相对较高的LOH频率，提示D9S161～D9S1853之间是部分鼻咽癌患者的较小共同缺失区(约2.7cM)。该区域位于9p21.1，距p16/MTS-1基因约14.0cM。p16/MTS-1基因是新近确定位于9p21区域的抑瘤基因，其产物p16蛋白和CDK4或CDK6结合，在G₁期控制细胞的增生。在多种肿瘤如乳腺癌、肺癌、食管癌、膀胱癌及鼻咽癌中已发现其存在杂合性和纯合性缺失，故认为p16/MTS-1基因是多种肿瘤9p21～22区域抑瘤基因的主要候选者^［4-6］。但较多的研究结果表明，在9p21～22区域可能还存在除p16/MTS-1基因外的其他未知抑瘤基因。在乳腺癌中，Han 和Brenner的不同研究表明，9p21～22区域等位基因的最小共同缺失区在p16/MTS-1基因附近的D9S171～D9S169间^［2］。Jonathan等^［8］在肺癌的9p21～22区域LOH研究中发现，其最小共同缺失区位于距p16/MTS-1基因约8cM的D9S171～D9S259间。Tarmin等^［7］发现食管癌9p的LOH高频区是距p16/MTS-1基因较远的D9S165位点。Pamela等^［6］在研究原发性头颈部癌9p21～22区域的LOH中发现，D9S171和D9S161位点的LOH频率高于距p16/MTS-1基因最近的D9S1747位点。我们的研究结果亦显示，鼻咽癌9p21～22区域的较小共同缺失区在D9S161～D9S1853间，而距p16/MTS-1基因较近的D9S1870位点LOH频率较低，为16.7%(3/18)。因此，在D9S161～D9S1853间可能存在与鼻咽癌相关的抑瘤基因。为发现该区域内可能存在的鼻咽癌相关抑瘤基因，我们采用定位-候选克隆策略，在GenBank中筛选出D9S161～D9S1853区域内25个代表新基因的3′端ESTs（express sequence tags)序列，并检测其在鼻咽癌中的表达差异情况。目前已发现了一个EST(dbEST: 208825)在鼻咽癌中表达降低，并已克隆出该新基因的全长cDNA（GenBank登录号：AF149298），该新基因是否为鼻咽癌抑瘤基因的候选者尚在研究中。

　　此外，定位于9p21～22 区域的还有两个已知基因IFNA和MTAP，虽在胶质瘤、肺癌等中发现其有缺失，但在黑色素瘤等肿瘤中已被排除作为抑瘤基因的候选者^［9］。在本研究中，IFNA和MTAP基因位于LOH高频率区D9S161～D9S1853 以外，因此，IFNA和MTAP基因可能亦不是鼻咽癌抑瘤基因的候选者。本研究结果还显示，9p21～22的等位基因缺失与鼻咽癌的临床分期无显著相关性，说明该区域的抑瘤基因可能与鼻咽癌的发生和发展密切相关。

　　本课题受国家863项目(编号 102-10-01-05)和973国家重点项目资助

　　参考文献

　　1　Huang DP, Lo KW, Hasselt CAV, et al. A region of homozygous deletion on chromosome 9p21～22 in primary nasopharyneal carcinoma. Cancer Res, 1994, 54: 4003-4006.

　　2　An H X, Niederacher D, Picard F, et al. Frequent allele loss on 9p21～22 defines a smallest common region in the vicinity of the CDKN2 gene in sporadic breast cancer. Genes Chromosome Cancer, 1996, 17: 14-20.

　　3　Merlo A, Gabrielson E, Askin F, et al. Frequent loss of chromosome 9 in human primary non-smallcell lung cancer. Cancer Res, 1994, 54: 640-642.

　　4　Kamb A, Gruis NA, Weaver-Feldhaus J, et al. A cell regulator potentially involved in genesis of many tumor types. Science, 1994,264: 436-440.

　　5　Lo K W, Huang D P, Lau KM. p16 Gene alteration in nasopharyngeal carcinoma. Cancer Res, 1995, 55: 2039-2043.

　　6　Pamela V, Sandra D, Cheng Q C, et al. Genetic alteration of chromosome band 9p21～22 in head and neck cancer are not restricted to p16 INK4a. Oncogene, 1997,15: 1699-1704.

　　7　Tarmin L, Yin J, Zhou X, et al. Frequent loss of heterozygosity on chromosome 9 in adenocarcinoma and sequamous cell carcinoma of the esophagus. Cancer Res, 1994, 54: 6094- 6096.

　　8　Jonathan SW, Willur AF, John TO, et al. Identification of a novel region of homozygous deletion on chromosome 9p in squamous cell carcinoma of the lung: the location of a putative tumor suppessor gene. Cancer Res, 1997, 57: 1-6.

　　9　Coleman A, Fountain JW, Nobori T, et al. Distinct deletion of chromosome 9p associated with melanoma versus glioma, lung cancer and leukemia. Cancer Res, 1994, 54:344-348.

(收稿：1999-01-22　　修回：1999-06-07)s