前列腺癌基因诊断最新进展
癌症1999年第18卷增刊
李荔霞 王晓怀
关键词：逆转录PCR；前列腺肿瘤/血液；基因；RNA信使
中图号：R73；R737.2
前列腺癌是男性生殖系统常见的恶性肿瘤之一，近年来发病率有逐年上升趋势，目前对于前列腺癌仍缺乏有效治疗手段，转移及复发是前列腺癌死亡的重要原因之一。早期诊断、及时治疗是提高前列腺癌疗效的重要措施，目前针对该疾病的实验室检查如前列腺特异抗原(Prostate specific antigen,PSA)血清学检查、骨扫描、前列腺活检、免疫荧光实验及流式细胞仪等均无法检测出存在于血液、骨髓及淋巴结等处的前列腺癌微转移灶。前列腺癌主要通过血道向远处转移，血液中微转移癌细胞的检测对于前列腺癌的早期诊断、疗效观察及预后判断均具有重大意义。近年来，随着分子生物学技术的发展，特别是逆转录聚合酶链反应(Reverse transcrip-tion-polymerase chain reaction,RT-PCR),经PCR循环后，可以使单拷贝基因经过35个循环后变成109，敏感度极高，可检测出每毫升血中含有的一个转移癌细胞，且极少出现假阳性，故特异性强，已成为检测微转移癌细胞的新手段，目前是人们研究的热点，本文就这方面的最新进展作一综述。
1 RT-PCR技术的发展史
早在1985年，Mullis发明了PCR技术。1988年，该技术就已经成为检测血液中恶性肿瘤微小残余疾病的一种新工具〔1〕。RTPCR技术是在PCR基础上发展起来的基因诊断工具，进一步完善了PCR，它运用逆转录，可在细胞群中检测出组织特异细胞标志物，而不需要肿瘤细胞发生特异的突变或基因重组。该技术的基本原理是由mRNA逆转录产生的cDNA链作为模板进行PCR扩增。有关的报道最早见于1990年Vessella等人的研究〔2〕。作者运用RTPCR技术，在已发生转移的前列腺癌患者的淋巴结及骨髓中检测出PSA。外周血特异标志物的测定具有更大的意义。1992年Moreno等检测了12例DO3期前列腺癌患者和17例对照组外周血中的PSAmRNA〔3〕,结果12例患者中4例为阳性，对照组均阴性。此项研究为了解和治疗前列腺癌以及其他常见恶性肿瘤开辟了一条新路。
RT-PCR技术的低假阳性率(0.8％)和高检测率(88％)表明该技术在临床有效诊断形式中具有不容忽视的地位。现有的RTPCR技术已能对前列癌进行分子分期，且测定的标志物水平随分子分期的提高而升高。Ghossein等测定了伴有局部或远处转移的前列腺癌患者血中的PSAmRNA表达后发现〔4〕，癌肿局限于原发器官的(T1-2)阳必为16％，T3-4或N＋期阳性率为30％，有远处转移者为35％，表明血液中PSAmRNA的表达与Dukes分期有关，除了可以检测血液、淋巴结及骨髓等的微转移癌细胞外，还可以做为判断前列腺癌预后的一个重要指标。
2 标志基因的选择
RT-PCR技术检测外周血肿瘤细胞，关键在于选择肿瘤细胞特异表达而血细胞不表达的基因即标志基因。作为前列腺癌传统的标志物PSA，已远远不能满足临床的需要。选择或配合其它的靶RNA将提高RT-PCR检测水平及结果的可靠性。
2.1PSA是一种血清蛋白酶，分子量为34KD，其合成仅限于前列腺上皮，前列腺良恶性疾病均可见血清PSA水平升高。在男性，PSA为前列腺特异性，在女性，有报道正常的子宫内膜及某些确诊的乳腺和卵巢癌患者中也有PSA表达〔1〕
2.2前列腺特异性膜抗原(Prostatespecificmembraneantigen,PSMA或PSM)是近年来克隆出的一种膜结合糖蛋白，分子量为100KD，是一种细胞膜表面标志物，和转铁蛋白有序列同源性〔5〕，其含量在抗激素治疗的患者中最高。Israeli等人研究发现〔6〕，用PTPCR技术检测外周血循环中前列腺细胞的PSMmRNA,有效性要高于PSAmRNA。Loric等人用PSM引物代替PSA引物提高了RT-PCR的敏感度〔7〕。作者采集了病人和对照组各20ml血，检测血液中PSMmRNA，33个病人中28个为阳性，而11个前列腺癌患者均未检出PSAmRNA，表明RTPCR检测循环中前列腺细胞PSMmRNA表达比PSAmRNA更敏感，而且在PSAmRNA表达阴性时仍然可以做为前列腺细胞的指标，理由是前列腺细胞的生长和增生受雄激素调节，PSAmRNA和PSMmRNA的表达分别受雄激素上、下调节。抗雄激素治疗普遍应用于前列腺癌患者，因此当前列腺癌患者接受了抗雄激素治疗后，PSAmRNA表达受到抑制，而PSMmRNA表达升高。正常前列腺上皮和恶性前列腺细胞均可产生PSA和PSM，但在高度未分化癌中的PSA的表达减弱或消失，而PSM的表达可以更好地保留〔1〕。目前更多的学者倾向于选择PSMA做为前列腺癌标志物。随着RT-PCR技术的进一步改善，PSMmRNA有望成为一种新的可检测原发性肿瘤和潜在的转移性肿瘤的标志物。
2.3hk家族(Prostate-specific human kallikrein,hk)作为一种新的标志物，已引起了一定的重视。hk是由前列腺上皮细胞产生的一类hk家族，包括hk2、hk3等，主要通过雄激素调节。 Young等制备了hk2的多克隆和单克隆特异抗体，应用免疫组化方法测定血清及组织中hk2蛋白，并用RT-PCR技术检测前列腺癌患者血中的hk2mRNA，结果表明所用的抗体为hk2特异性抗体，而hk2只在前列腺上皮中表达，所以hk2将可能成为早期检测前列腺癌微转移的有用标志物之一〔8〕。 kawakami等比较了hklk2与hklk3mRNA表达发现，hklk2mRNA的表达与抗雄激素治疗反应相关，hklk3mRNA表达与抗雄激素治疗反应无关。另外，检测病人外周血hklk2mRNA适用于一些不表达hk3的前列腺癌患者〔9〕。hk2与PSA标志物的结合，亦可提高RT-PCR检测的特异性〔10〕。其它标志物还有PSP94〔11〕、Lipoxygenase120〔12〕及1996年9月欧洲泌尿系统疾病联合会议上，Pilarsky等报道的前列腺特异癌基因PTⅠ-1。
3 提高特异性、减少非特异性的措施
巢式逆转录PCR技术(nestedRT-PCR)即先用外引物作第一次扩增，再取第一次扩增产物用内引物作第二次扩增。因为采用了二次PCR扩增，而且在第一次扩增基础上应用内引物再次扩增，所以增加了敏感性和特异性。Loric等研究表明，检测前列腺细胞，巢式PCR比普通PCR敏感〔7〕。虽然巢式RTPCR敏感性增高，但是特异性往往减低了。Henke等采用巢式RT-PCR测定良性前列腺增生和前列腺癌患者血中PSAmRNA，结果发现随着灵敏度的增高，诊断特异性随之降低〔13〕。定量PCR的问世，可望解决这个问题，Brandt等应用定量竞争RT-PCR技术检测肿瘤患者血中的C-erbB-2mRNA,发现癌细胞以单个细胞或以聚集形式存在于患者血中〔14〕。这种定量竞争的RT-PCR方法，可以合理地被用来鉴定抗肿瘤治疗的有效性并作为辅助治疗决定的一项指标。提高检测敏感性的方法还有运用地高辛标记的脱氧核糖核酸，通过化学法光抗体检测，并对PCR产物进行C-TRAK比色分析〔1〕。
4 问题与展望
4.1可靠性
运用RT－PCR对前列腺癌进行分子分期已成为研究的热点之一，但是测定结果的可靠性还存在着一些分歧。Israeli测定了18例PT1－PT3期前列腺癌患者血中的PSM，阳性为13例，15例PT3＋期患者中阳性为9例，阳性率分别为72％和60％〔6〕。原因可能是某实验室RT－PCR技术检测敏感度太低，以致不能检测出有囊外病变的病例，或者由于检测局限于原发器官的肿瘤时出现太多的假阳性。毫无疑问，一旦各实验室之间实现了标准化，分子分期将成为可能，必将为外科治疗及前列腺癌的预后提供重要的信息。
4.2RT－PCR技术的局限性
虽然RT－PCR对术前局部分期方面有一定的帮助，但由于存在着非特异性，临床应用上还有一定困难。随着RT－PCR敏感度的提高，在非前列腺癌中得到阳性结果即假阳性的可能性越来越大。尽管巢式PCR的出现可能在一定程度上减少假阳性的发生，但是目前技术上仍然无法绝对杜绝假阳性的出现。Smith等人报道不仅在一些非前列腺癌细胞系中检测到PSAmRNA，还在7个健康男性，6个健康女性的血中检测到了PSAmRNA〔15〕。Thiounn等测定了46例T1－T2期前列腺癌，94例前列腺良性增生及51例无前列腺癌患者外周血中的PSAmRNA，阳性率分别为22％，8.5％和176％〔16〕，说明RT－PCR的应用仍有一定的限制，通过严格无RNA实验操作并设立阴性、阳性对照，可以大大减少假阳性和假阴性的发生。
4.3前列腺的操作对RT－PCR的影响
前列腺操作对RT－PCR的检测结果有一定影响，如经尿道前列腺切除术、前列腺根治术、经直肠超声活检术等均有一定影响〔17－19〕。例如在50例行直肠超声活检术的患者中，术前RT－PCR检测血PSAmRNA均为阴性，4例术后转为阳性，可能是手术时前列腺受伤使前列腺细胞进入手术区域，部分进入外周循环。现有的理论尚不能解释自发性RT－PCR阳性。在某些情况下，潜在的转移表型可以解释RT－PCR阳性，而有些病例，PSA和PSMA合成细胞也许根本没有转移的潜能。因此在下结论之前，需要对这类细胞的生物半衰期进行深入研究。鉴于上述原因，将来对前列腺癌进行的分子分期，要选择在前列腺的操作之前〔20〕。
随着分子生物学研究的进一步深入，肿瘤特异基因改变将逐渐被人们所认识和利用，外周血肿瘤细胞的检测不仅有助于前列腺癌的分期，判断预后和治疗效果，而且有助于深入探讨肿瘤复发和转移的可能机制。既往的RT－PCR技术有望得以改善，新的肿瘤特异标志基因有待开发，这些都将在肿瘤的临床诊断和治疗方面发挥更大的作用。
作者单位：广州军区广州总医院肿瘤科(广州，510010)
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编辑及校对：杨允贵
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