前列腺癌DNA倍体、PCNA、iMVD免疫组化研究

中华泌尿外科杂志 1999年第1期第20卷 论　　著

作者：李金庆　项锋钢　董绍萃　牛兆山　马卫海　申东亮

单位：李金庆　董绍萃　马卫海（266042 青岛医学院第二附属医院泌尿外科）；项锋钢　牛兆山（青岛医学院病理解剖教研室）；申东亮（青岛医学院附属医院泌尿外科）

　　关键词： 前列腺肿瘤；癌；免疫组织化学

　　【摘要】　目的　探讨前列腺癌DNA倍体、增殖细胞核抗原(PCNA)、微血管密度(iMVD)与癌分级及预后的关系。　方法　应用计算机图像分析技术、免疫组织化学(LSAB)法，测定30例前列腺癌(PC)、20例前列腺增生症(BPH)细胞核DNA倍体、PCNA阳性指数、iMVD的变化。　结果　随癌分化程度降低，DNA倍体增加、PCNA阳性指数升高、iMVD增加，其差异有显著性(P＜0.05或P＜0.01)；2年内死亡者，其DNA倍体、PCNA阳性指数、iMVD均高于存活2年以上者(均为P＜0.001)。　结论　iMVD较癌分级更准确地反映PC的预后。DNA倍体、PCNA阳性指数、iMVD间均呈正相关关系。

DNA ploidy、PCNA and iMVD in prostatic carcinoma

LI Jinqing,XIANG fenggang,DONG Shaocui, et al

　　department of Urology, The 2nd Affiliated Hospital of Qingdao Medical college,Qingdao 266042

　　【Abstract】　Objective　To determine the relationship between these biologic markers and tumor grade and prognosis of the carcinoma.　Metheds　30 cases of prostatic carcinoma (PC) and 20 cases of benign prostatic hyperplasia (BPH) were studied on DNA ploidy proliferating cell nuclear antigen (PCNA) and intratumoral microvascular density (iMVD) with computer-assisted image analysis and immunohistochemistry (LSAB). 　Results　The dNA ploidy,PCNA labeling index and iMVD were increased along with decreasing of the tumor histological grading.The DNA ploidy was significantly different among pC₃、PC₂、PC₁ and BPH (P＜0.05 or P＜0.01), so were the PCNA labeling index and iMVD (P＜0.05 or P＜0.01).The dNA ploidy、PCNA labeling index and iMVD were higher in patients with prostatic carcinoma died within two years than those survived for over two years (P＜0.001).　Conclusions　iMVD is a more accurate predictor than tumor grading in the evaluation of the prognosis of prostatic carcinoma. DNA ploidy, PCNA labeling index and iMVD were positively correlated with each other in prostatic carcinoma.

　　【Key words】　Prostate neoplasms　　Carcinoma　　Immunohistochemistry

　　应用计算机图像分析技术，定量测定30例前列腺癌(Pc)、20例前列腺增生症(BPH)细胞DNA倍体，采用免疫组织化学(LSAB)法，定量计数增殖细胞核抗原(PCNA)表达，用能识别微血管内皮细胞的抗F_Ⅷ相关抗原单克隆抗体，显示肿瘤间质内微血管密度(iMVD)，探讨DNA倍体、PCNA阳性指数、iMVD与癌分级、预后的关系。

　　材料与方法

　　一、材料

　　前列腺癌30例。年龄54～82岁，平均68岁。高分化腺癌(PC₁)7例，中分化腺癌(PC₂)8例，低分化腺癌(PC₃)15例。30例全部随访，2年内死亡8例，尚存活12例，存活2年以上10例。前列腺增生症20例，年龄53～78岁，平均69岁，随访均健在。

　　二、试剂

　　鼠抗人PCNA单克隆抗体(PC10)、鼠抗人F_Ⅷ单克隆抗体(F8)、LSAB试剂盒均系DaKo公司产品。

　　三、方法

　　组织均为10%甲醛固定，常规石蜡包埋，5μm厚连续切片，HE染色复查。DNA染色采用Fenlger染色法，以德国产的VIDAS型全自动图像分析仪，随机选择一个高倍视野(×400)，测定视野内全部肿瘤细胞的DNA相对含量，并测定同切片内淋巴细胞的DNA相对含量，作为DNA正常二倍体（2C）含量对照。免疫组织化学采用LSAB法，F_Ⅷ：常规脱蜡至水，经0.05%胰蛋白酶消化，F_Ⅷ工作液浓度1:200，在10×20倍的视野下计数微血管个数，每例切片计数10个视野，取其平均值，以每个视野为0.723mm²换算成mm²内微血管个数，即微血管密度。PCNA：省去胰蛋白酶消化，PCNA工作液浓度1:100，每张切片随机观察5个高倍视野，每个视野计100个肿瘤细胞，计算平均每100个细胞中阳性细胞数，即阳性指数。已知肺癌阳性片作阳性对照，PBS缓冲液代替一抗作阴性对照。

　　四、结果判定标准

　　DNA倍体：(1)2C及近2C：1.8～2.5C，(2)增殖倍体：2.5～5.0C，(3)异多倍体：＞5.0C。PCNA：以细胞核呈边界清楚的棕褐色反应者为阳性。微血管计数：凡染成棕色单个内皮或内皮细胞簇均作一个血管计数，不以红细胞及管腔出现来计数血管，直径大于8个红细胞直径、带有较厚肌层和硬化区血管均不计数。

　　五、统计学处理

　　采用方差分析、t检验、秩和检验及Spearman等级秩相关检验。

　　结　　果

　　一、BPH与PC的DNA倍体、PCNA阳性指数、微血管密度结果见表1

　　BPH病人DNA均为2C，PC随癌细胞分化程度降低，DNA倍体增加，差异均有极显著性。PC病人PCNA阳性指数明显高于BPH，并随癌分化降低而逐渐增加，差异均有极显著性。PC的iMVD明显高于BPH，随癌分化降低而逐渐增加，差异均有极显著性。

表1　BPH、PC的DNA倍体、PCNA、iMVD(±s)

　　与BPH比较，#P＜0.01；与PC1比较，△P＜0.05、△△P＜0.01；与PC2比较*P＜0.05　**P＜0.01　二、不同预后病人DNA倍体、PCNA、iMVD结果见表2

　　2年内死亡者其DNA倍体、PCNA阳性指数、iMVD均高于存活2年以上者，差异均有极显著性。在2年内死亡病例中，有2例中分化腺癌，其DNA倍体为7.14C、8.29C，PCNA阳性指数分别为64%、80%，iMVD为59.0、77.5。3例存活3年以上的低分化腺癌，其DNA倍体为6.74C、7.34C、6.97C，PCNA阳性指数分别为：55%、70%、60%，iMVD为34.9、53.8、39.4。因例数少，无法进行统计分析，但仍可看出，在这三项指标中iMVD较癌分级更好地反映预后。

表2　不同预后病人DNA倍体、PCNA、iMVD(±s)

　　*P＜0.001　　三、PC病人的DNA倍体、PCNA及iMVD的关系

　　DNA倍体分为增殖倍体和异多倍体。PCNA阳性指数按以下标准半定量分级：≤25%为Ⅰ级，26%～为Ⅱ级，51%～为Ⅲ级，76%～100%为Ⅳ级。iMVD以BPH的微血管密度均值为标准进行：＜16.4%为（-），16.5%～32.8%为（＋），32.9%～65.6%为(＋＋)，＞65.7%为(＋＋＋)。30例PC半定量分级见表3。在增殖倍体组，PCNA为Ⅰ、Ⅱ级，iMVD为轻至中度增高；在异多倍体组，PCNA大多为Ⅲ、Ⅳ级，iMVD为中至重度增高。

表3　PC的DNA倍体、PCNA及iMVD半定量分级

　　以原始数据对三者进行Spearman等级秩相关检验，DNA倍体与PCNA：rs＝0.9613，P＜0.001，DNA倍体与iMVD:rs=0.9274，P＜0.001,PCNA与iMVD:rs=0.9226，P＜0.001,三者间均存在正相关关系。讨　　论

　　本研究结果表明，前列腺增生症细胞核DNA倍体均在二倍体范围内，前列腺癌随癌分化降低，细胞核DNA倍体逐渐增加，与文献报道一致^［1，2］。本组2年内死亡者DNA倍体明显高于存活2年以上者，表明癌细胞核内DNA含量高，预后差。

　　PCNA为非组织酸性核酸蛋白，是反映细胞增殖活性的标志物^［3，4］。本研究结果显示，前列腺癌的PCNA阳性指数明显高于前列腺增生症，随癌分化程度降低，PCNA阳性指数增加。说明随癌分化程度降低，进入细胞周期的增殖细胞增多，反映了癌的恶性程度增高。2年内死亡者PCNA阳性指数显著高于存活2年以上者，说明PCNA阳性指数可反映前列腺癌的预后。

　　自Folkman^［5］于1971年提出肿瘤生长依赖于新生血管形成的概念后，陆续报道了肿瘤生长、转移与血管生成的关系^［6,7］。内皮细胞作为肿瘤血管生成因子的效应细胞在肿瘤血管生成中具有关键性作用。用能识别微血管内皮细胞的抗F_Ⅷ相关抗原单克隆抗体进行免疫组化染色，能很好地显示癌组织内微血管的分布情况，并进行定量计数^［8］。本研究结果显示前列腺癌较前列腺增生症组织内微血管密度明显增加，说明癌生长与血管形成有关，随着癌分化降低，肿瘤内微血管密度增加，2年内死亡者较存活2年以上者肿瘤内微血管密度明显增加。本组2例中分化前列腺患者肿瘤微血管密度高，病人2年内死亡；3例低分化前列腺腺癌者肿瘤微血管密度较低，均存活3年以上。说明微血管密度与预后关系密切，比分级能更准确地反映前列腺癌的预后。

　　对前列腺癌的DNA倍体、PCNA阳性指数及微血管密度秩相关分析表明，三者间均存在正相关关系。说明微血管密度高，DNA倍体增加，PCNA阳性指数增加，三者综合分析，能更好地反映前列腺癌的预后。

　　参考文献

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(收稿：1997-09-18　修回：1998-09-24)