前体药物甲氨喋呤-α-肽对前列腺癌动物模型治疗的研究

中国肿瘤生物治疗杂志 2000年第3期第7卷 论著

作者：郝晓柯　施溥涛　张盈华　殷缨　韩云龙

单位：施溥涛（中国科学院上海生化研究所）；郝晓柯　张盈华　殷缨　韩云龙（第四军医大学唐都医院中心实验室　西安　710038）

关键词：前体药物；前列腺肿瘤；导向治疗

　　摘　要　目的： 研究前列腺癌的导向酶-前体药物疗法（ADEPT），在体内观察前体药物甲氨喋呤-α-肽对前列腺癌的作用。方法： 用前体药物甲氨喋呤-α-苯丙氨酸(MTX-α-Phe )和甲氨喋呤-α-精氨酸(MTX-α-Arg)对前列腺癌荷瘤裸鼠模型行肿瘤生长抑制及药物动力学的观察。结果： 经抗人精浆蛋白单克隆抗体导向的羧肽酶-A-MTX-α-Phe 动物模型体内试验，ADEPT治疗组肿瘤生长明显抑制，裸鼠生存时间延长，生活质量优于单用MTX组。药物动力学显示，抗人精浆蛋白单克隆抗体-羧肽酶A 注入72 h 后 ，给于 MTX-α-Phe治疗效果最佳。结论： MTX-α-Phe+CP-A是一理想的前列腺癌的ADEPT 对。

　　《中国图书资料分类法》分类号　R737.25

The Effect of Prodrugs MTX-α-Peptides on Prostate Cancer Model in Nude Mice

Hao Xiaoke，Shi Putao， Zhang Yinghua， Yin Ying， Han Yunlong

　　(Clinical Medical Research Centre，Tang-du Hospital，Fourth Military Medical University， Xi'an 710038)

　　Abstract　Objective　To evaluate the inhibition efficiency of the antibody-directed enzyme prodrug therapy (ADEPT) on the prostate cancer, the effect of MTX-α-peptides was observed in vivo.Methods: The growth inhibition and the pharmacokinetics were observed using the prodrugs of MTX-α-Phe and MTX-α-Arg on the mice model bearing with the prostate cancer.Results: The tumor growth was inhibited and survived time of the nude mice was prolonged and life quality was improved in the group treatment with the ADEPT compared with the group of MTX therapy. The ADEPT was carried out on the mouse model by carboxypeptidase-A (CP-A) combined with MTX-α-Phe which was guided by the anti-γ-seminoprotein monoclonal antibody.Conclusion: The MTX-α-Phe combined with CP-A was an ideal ADEPT pair.

　　Key words prodrug； prostate tumor； guiding therapy

　　前体药物是一类本身无活性或活性很低，但在体内可转化为活性物质的药物。利用肿瘤抗体作为载体携带前体药物的专一性活化酶，选择性的结合于肿瘤部位，使前体药物区域特异性的在肿瘤组织内转化为活性细胞毒分子，称为“抗体导向酶-前体药物疗法”(antibody-directed enzyme prodrug therapy, ADEPT)，它是近年来肿瘤抗体导向治疗研究中一项引人注目的新进展^［1,2］。因其克服了当前化学免疫偶联物和免疫毒素存在的许多问题，引起了人们的广泛关注。^［3,4］。目前，此研究国外正处于发展与完善阶段，但国内未见报道。我们合成了用于治疗前列腺癌的前导药物:甲氨喋呤-α-肽衍生物，在对前列腺癌细胞体外毒性试验的基础上^［5］，对前列腺癌动物模型行体内试验，取得了较满意的效果。

　　1　材料与方法

　　1.1　主要试剂及细胞

　　甲氨喋呤(MTX)为上海第十二制药厂产品(药品批准文号沪卫准字0391-012)。甲氨喋呤-α-肽衍生物：甲氨喋呤-α-苯丙氨酸(MTX-α-Phe)由本室合成，经高效液相色谱测定为单峰，激光质谱仪测定其分子量与理论值一致^［6］。羧肽酶-A（carboxypeptidase A type Ⅰ，CP-A)为Sigma公司产品。抗人精浆蛋白单克隆抗体-羧肽酶A偶联物(γ-SmMcAb-CP-A)由本室制备，其CP-A的酶活性是20 U/mg（CP-A∶McAb）。

　　人前列腺癌细胞株PC-3(低转移性)和PC-3m(高转移性)由北京医科大学病理教研室从美国引进。在RPMI 1640完全培养基（内含150 ml/L胎牛血清），37℃，5%CO₂条件下培养，2.5 ml/L胰酶消化转代。

　　1.2　肿瘤模型

　　4～6周龄BALB/c裸鼠(第四军医大学动物中心提供)，体重16～20 g，无菌隔离器内饲养。于臀部皮下接种人前列腺癌细胞PC-3m悬液0.1 ml（1×10⁷细胞），至瘤体大约0.5 cm³ 时开始给药。

　　1.3　动物模型体内试验

　　1.3.1　分组与治疗

　　40只荷瘤裸鼠按瘤体大小随机分组:①对照组，给予生理盐水0.5 ml，静脉给药；②治疗组Ⅰ，MTX 5 mg/kg，静脉给药；③治疗组Ⅱ，MTX-α-Phe 5.32 mg/kg，静脉给药；④治疗组Ⅲ，精浆蛋白单抗-羧肽酶A偶联物(γ-SmMcAb-CP-A)0.5 ml，静脉给药；⑤治疗组Ⅳ，先静脉给于偶联物0.5 ml，72 h后再静脉给予MTX-α-Phe 5.32 mg/kg (即ADEPT疗法)。

　　1.3.2　观察指标

　　1.3.2.1　γ-SmMcAb-CP-A偶联物在体内的分布

　　用¹²⁵I标记偶联物，静脉注射后第12，24，48，72和96小时行ECT显像，观察抗体的定位情况，并各处死2只裸鼠取肿瘤、脑、心、肝、脾、肺、肾、胃、小肠、肠系膜淋巴结、骨骼肌、卵巢、睾丸，称重后一部分直接测定血液及各脏器的放射性，另一部分用9 g/L NaCl溶液制成组织匀浆，取一定量的组织匀浆，加等量200 ml/L三氯醋酸沉淀，测沉淀部分的放射性，计算组织中偶联物的含量。

　　1.3.2.2　抑瘤率：给药后每周测定瘤体长径与短径，计算瘤质量(m =1/2×长径×短径²)，并计算肿瘤生长抑制率(抑瘤率)。

　　1.3.2.3　肿瘤细胞生长周期时间：t_c =［lg（1+ G）/lg（m₂/m₁）］×t，G 为肿瘤生长组分，m₂，m₁ 为某组分中不同观察时间的肿瘤质量，t为观察间隔时间。

　　1.3.2.4　裸鼠生存时间：指从接受治疗到自然死亡的时间。

　　1.3.2.5　病理组织学观察：包括大体标本检查及镜检，取肿瘤组织及重要脏器的组织，100 ml/L福尔马林固定，石蜡包埋切片，HE染色，光镜下观察。

　　2　结　果

　　2.1　偶联物在体内的分布

　　注射¹²⁵Ⅰ标记物后第12，24，48，72，96小时，血液、肿瘤及各脏器偶联物的分布见表1。ECT扫描见肿瘤部位有明显核素聚集(图1),以72 h最佳, T/NT值12.65。说明抗体可以很好的携带偶联物定位于肿瘤部位。

表1　静脉注射¹²⁵I-γ-SmMcAb-CPA后不同时间点的脏器分布比较

　　Tab.1　Comparison of tissue distribution of γ-SmMcAb-CPA in different by intraveous injection ¹²⁵I-γ-SmMcAb-CPA

　　1～15: liver, stomach, kidney, lung, heart, muscle, brain, lymph-node, intestine, stomach, thyroid, testes, ovary, blood, tumor.2.2　肿瘤体积的动态观察

　　第1周内，各组肿瘤体积无明显差异。从第2周起，治疗组Ⅰ，Ⅳ肿瘤生长开始减慢，生长受到抑制。第6周时，治疗组Ⅰ，Ⅳ的肿瘤体积明显小于其它组，其中Ⅳ组(ADEPT组)有7只肿瘤明显缩小，1只基本消失，肿瘤抑制率明显高于其它组(P＜0.001)。治疗组Ⅱ，Ⅲ与对照组相比虽有缩小，但无差异(P＞0.05)，对照组肿瘤生长很快，部份肿瘤到后期发生溃破(图2)。

　　2.3　肿瘤细胞生长周期时间、裸鼠生存时间的比较

　　各组荷瘤裸鼠肿瘤细胞生长周期时间和生存期，对照组肿瘤生长快，细丙生长周期时间为(1.5±0.1) d，其中3只发生腹腔脏器广泛转移，严重腹水，恶异质严重，平均生存期为(28±11.7) d。治疗组Ⅱ，Ⅲ与对照组无明显变化(P＜0.05)，细胞生长周期时间为(1.7±0.2) d和(1.9±0.1) d，平均生存期分别为(31±12.2) d和(35±14.1) d。单用MTX(治疗组Ⅰ)虽然肿瘤生长受到抑制, 但荷瘤裸鼠生活质量较差，全血细胞数明显低于ADEPT组(P＜0.01)，细胞生长周期时间为(2.5±0.2) d，生存期为(67±13.8) d。而ADEPT组的细胞生长周期时间最长，为(3.1±0.2) d，生存期平均为(89±12.9) d。

图1　¹²⁵I-偶联物放射免疫显像图

　　Fig.1　The radioimmunoimaging of ¹²⁵I-γ-SmMoAb-CP-A

图2　肿瘤生长曲线

　　Fig.2　Growth curves of tumor cells

　　2.4　组织病理学检查

　　经过5周治疗后，治疗组Ⅰ，Ⅳ大体标本检查见肿瘤大面积坏死，切面呈黄白色，组织松脆，仅在周边部残留包膜及少量瘤组织，镜下见坏死瘤组织内散在片状钙化，癌细胞仅残留轮廓。而对照组及治疗组Ⅱ，Ⅲ呈腺癌典型表现, 癌细胞生长活跃，有转移的裸鼠腹腔脏器发生广泛癌组织浸润（图3）。

　　3　讨　论

　　ADEPT疗法最早由 Bagshawoe^［1］在1987年提出的，他从绿脓杆菌中分离羧肽酶G₂，并且克隆入大肠杆菌，最初是用来水解甲氨喋呤，后来用于切除苯甲酸氮芥衍生物上的谷氨酸部分使之活化。这是目前最具代表性的一套ADEPT系统，而且已进入小规模临床试验阶段^［7］。ADEPT方案的优势在于一个分子酶可以转化很多个分子的前药，每摩尔羧肽酶G₂在1 s可降解800 mol苯甲酸氮芥底物，在肿瘤部位产生高浓度的活性药物，这样可以弥补临床应用中免疫交联物结合力较低的缺点，另有证据表明，在肿瘤细胞表面产生高浓度药物比全身应用同等浓度的活性药物更加有效^［8］。我们在实验中应用ADEPT治疗组肿瘤抑制比单用MTX治疗组明显，而且动物生活质量也明显优于单用MTX治疗。

图3　ADEPT治疗的形态学表现

　　Fig.3　Morphology of ADEPT therapy

　　A： HE staining (80×), therapy groups,show tumor cell are

　　necrosis; B： HE staining (200×)，therapy groups;

　　C： HE staining (800×), conrtol groups, show typical

　　morphology of adenocarcinoma; D： HE staining (400×),

　　conrtol groups, show intrude into muscular tunic by cancerous cell

　　关于ADEPT疗法的给药途径，国外有许多不同的报道，Huennekens等^［8］ 将抗人肺癌McAbKS14与CPA交联，体外肺癌细胞毒性试验发现，前药的IC₅₀为8.9×10^-6 mol/L，加入交联物和前药48 h后，IC₅₀为1.5×10^-6 mol/L，降低了6倍。延长作用时间，前药的细胞毒活性接近 MTX（IC₅₀为2×10^-9 mol/L）,很显然酶转化底物的速率很慢，但作者指出，在肿瘤局部转化得到的MTX要比相同浓度的自由MTX更加有效,而且这一限速步骤正是药物从毛细血管向血管外肿瘤细胞扩散的时间。静脉给药体内应用，大多认为注射交联物后72 h 给前药是最佳方案。Stribbling 等用高压液相色谱测定了A₅B₇ F(ab')₂-CPG₂交联物在裸鼠体内的分布状况，静脉注射交联物至少72 h后才可以达到理想的肿瘤/正常组织分布比例^［9］。我们用¹²⁵I标记γ-SmMcAb-CP-A偶联物，测定其在体内的分布及行ECT显像，结果证明，静脉注射偶联物后72 h的肿瘤/正常组织分布比例最佳。

　　ADEPT疗法是当前肿瘤导向治疗研究的热点，但到目前为止，进入临床体内试验的报道不多。有许多关键问题亟待解决，如现在用的都是鼠源性单抗和非人源化酶，存在着免疫源性的问题。解决的办法是使用人源化单抗和酶，目前我们已经构建了人精浆蛋白单链抗体/人源化羧肽酶A融合基因，用于前列腺癌的ADEPT治疗，研究已取得部分进展（另篇报道）。

　　本课题受国胶自然科学基金青年基金(39300158)资助.

　　郝晓柯,男,40岁,教授,主任医师,硕士研究生导师,主要从事肿瘤导向治疗的研究.

　　参 考 文 献

　　1，Bagshawoe KD. Antibody-directed enzymes reviveanti-cancer prodrugs concept. Br J Cancer, 1987, 56(5): 531

　　2，Perron MJ， Page M. Activation of methotrexate-phenytatanine by monoclonal antibody-canboxypentidase A conjugate for these pcifiec treatment of ovarian cancer in vitro. B J Cancer, 1996, 73(3): 281

　　3，甄永苏. 抗肿瘤导向药物研究的现状与展望, 药学学报, 1994, 29(1): 1

　　4，周思群, 王耐勤. 抗体导向酶-前药疗法在肿瘤治疗研究中的应用. 中国药学杂志, 1994, 29(8): 451

　　5，施溥涛， 郝晓柯， 陈 颖， 等. 氨甲喋呤-a-肽的固相合成. 药学学报, 1997, 32(2): 106

　　6，郝晓柯， 施溥涛， 张盈华， 等. 前体药物甲氨喋呤-a-肽对前列腺癌细胞的细胞毒作用. 中华泌尿外科杂志, 1997, 18(10): 583

　　7，Bagshawe KD， Sharma SK， Springer CJ， et al. Antibody-directed enzyme prodrug therapy: A pilot-scale clinical trial. Tumor Targeting, 1995; 1: 17

　　8，Huennesekens E, Esswein A, Vitols KS， et al. Activation of methotrexate-alpha-alanine by carboxipeptidade-a-monoclonal antibodise conjugate. Biochemistry, 1992, 31: 891

　　9，Stribbling SM, Martin J, Pedley RB， et al. Biodistribution of an antibody-enzyme conjugate for antibody-directed enzyme produrug therapy in nude mice bearing a human colon adenocar-cinoma xenograft. Cancer Chemothher Pharmacol, 1997, 40(4): 277

(2000-01-09收稿； 2000-03-01修回)