P21、P185、P53蛋白表达及P53基因突变与膀胱癌移行细胞生物学行为关系的研究

　　第三军医大学学报2000年第22卷第2期

周占松　金锡御　宋波　熊恩庆

　　摘　要　目的：探讨癌基因及抑癌基因改变与膀胱癌生物学行为的关系。方法：采用免疫组织化学方法及分子生物学技术，检测了82例膀胱移行细胞癌P21、P185、 P53蛋白表达及38例P53基因突变。结果：P21、P185、P53蛋白表达阳性率分别为62.2％(51例)、58.5％(48例)、31.7％(26例)。12例(31.6％)有P53抑癌基因突变，其中全部有第280位密码子G-C突变；3例合并有248密码子突变；1例有249密码子点突变。结论：P21、P53蛋白表达阳性率与膀胱移行细胞癌病理分级及临床分期呈正相关(P＜0.01);P185蛋白阳性率与分级、分期呈负相关(P＜0.05)。P53抑癌基因点突变与病理分级和临床分期呈显示著正相关(P＜0.05);与预后时著相关(P＜0.05);且死亡率高于点突变阴性者。

　　关键词：膀胱肿瘤；癌；移行细胞；癌基因产物；预后

　　应用免疫组织化学及聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性分析和斑点杂交法检测膀胱移行细胞癌 ras，c-erb-2及P53蛋白表达及P53基因点突变，旨在探讨癌基因及抑癌基因的改变与膀胱移行细胞癌生物学行为的关系，为临床诊断及判断预后提供理论依据 。

　　1　材料与方法

　　1.1　材料

　　选取有完整随访资料的膀胱移行细胞癌手术标本82例，随访时间3～10年，平均5.2年，另取10例非癌膀胱粘膜作对照。标本经10％福尔马林固定、石蜡包埋。其 中对38例膀胱移行细胞癌标本进行基因突变检测。ras p21、P53鼠抗人抗体购自中山生物技术公司。P185鼠抗人抗体为美国OncogeneScience公司产品。ABC试剂盒为美国Vector Lab公司产品。P53基因引物及寡聚核苷酸探针由中科院上海细胞生物所合成。蛋白酶K、TaqDNA多聚酶、4种脱氧核苷酸、DNA分子量标记物，限制性内切酶MspⅠ、BstNⅠ 、HaeⅢ均购自华美生物工程公司。

　　1.2　临床资料

　　膀胱移行细胞癌82例，作基因产物(P21、P53、P183)检测，男70例，女12例。年龄26～82岁，平均56.34岁。肿瘤大小：最大直径8.5cm，最小者0.4cm。组织学分级：Ⅰ级18例 ，Ⅱ级38例，Ⅲ级26例。临床分期：Tis-T1期22例；T2期36例；T3～4期24例。82例随访结果，复发30例，死亡17例 ，其中4例复发后死亡。38例作基因突变检测，男33例，女5例，年龄25～80岁，平均年龄60.6岁。肿瘤组织学 分级：Ⅰ级10例，Ⅱ级15例，Ⅲ级13例。临床分期：Tis-T1期12例；T2期13例，T3～4期13例。38例随访结果：复发27例，死亡5例。

　　1.3　方法

　　1.3.1　免疫组化染色　石蜡包埋组织连续厚4μm切片。其中1张行HE染色，其组织病理分级按WHO标准，临床分期 采用UICC标准。免疫组织染色采用ABC法，一抗P21、P53、P185(1∶50)。以PBS代替第一或第二抗体作为阴性对照。以已知阳性切片作阳性对照。按染色范围及强度判断染色结果。

　　1.3.2　基因突变检测　①提取DNA；②聚合酶链式反应(PCR)；③酶切分析(RFLP)；④斑点杂交(dotblot)。

　　1.4　统计学分析

　　所有资料进行χ²检验。

　　2　结果

　　2.1　免疫组化结果分析

　　10例正常膀胱粘膜中，2例P185蛋白呈弱阳性，P21、P53蛋白均阴性。82例膀胱移行细胞癌中P21蛋白阳性率62.2％ (51例)，P53蛋白阳性率31.7％(26例)，P185蛋白阳性率58.5％(48例)。P21蛋白、P53蛋白与预后关系：本组82例膀胱移行细胞癌，复发30例，复发时间≤3年20例，3～5年3例，≥5年 7例。仅P53阳性者复发率33.6％，显著高于阴性者复发率(17.1％,P≤0.05)。各种蛋白表达与复发时间无关。死 亡17例，其中生存时间≤3年10例，3～5年4例，≥5年3例。P21阳性者死亡率33.4％，高于阴性者死亡率(6.2％，P＜0.01)。P53阳性者死亡率34.6％，高于阴性者死亡率(12.4％，P＜0.01)。与生存时间长短无明显关系。3种蛋白检测结果显示，2种以上基因产物表达者计32例(39％)，P21、P53蛋白共同表达阳性率10.7％，共同表达者复发率为63.2％，显著高于非共同表达者(P＜0.05)；P185，P53蛋白共同表达阳性率5.1％，其复发率为60.3％，显著高于非共同表达者P21，P185、P53蛋白共同表达阳性率24.6％。2种以上蛋白共同表达者复发率为29.6％，显著高于非共同表达者复发率(11.7％，P＜0.05)，而死亡率比较无显著差异(P＞0.05)，见表1。

表1　82例膀胱移行细胞癌P21、P185、P53蛋白表达结果Tab1　Results of expression of P21、P185、P53 protein in 82 cases of transitional cell carcinoma

Historical classification	P21			P185			P53
	+			+			+
Normal mucosa（n=10）	0	0	0	2	0	0	0	0	0
Transitional cell carcinoma（n=82）	13	15	23	20	12	16	13	7	6

　　2.2　P53基因突变结果分析

　　用PCR-RFLP方法对38例膀胱移行细胞癌组织P53基因检测发现，3例有248密码子点突变，1例有249密码子突变。 应用PCR-dotblot方法对38例膀胱癌组织DNA进行检测，发现12例发生P53基因280密码子G-C突变，没有发现175和273密码突变。P53基因突变随病理分级和临床分期增高而增 高(P＜0.01)。P53基因突变与预后关系：P53基因12个点突变阳性的病例全部复发，5例死亡；点突变阴性者10例复发(38.5％)，没有死亡病例。两者间差异非常显著(P＜0.01)。

　　3　讨论

　　本组对膀胱移行细胞癌P21蛋白检测结果表明：阳性率分别为Ⅰ级31％、Ⅱ级59％、Ⅲ级74％，各级间相 差显著(P＜0.05)；Tis-T1期29.7％、T2期61.2％、T3～4期74％，各期间相差显著(P＜0.05)。本文结果与文献报道基本相符^[1，2]，但亦有相反结论的报道^[3]。P21蛋白阳性表达者预后差，死亡率高，反之则预后好，死亡率低。因此我们认为P21蛋白表达可作为膀胱癌恶性程度高和预后不良的重要指标之一。

　　本实验对膀胱移行细胞癌P185蛋白检测结果表明：Ⅰ级69.6％、Ⅱ级56.4％、Ⅲ级41％；Tis-T1期68.1％、 t2期57.9％、T3～4期41％。统计学分析表明：各级及各期间相差显著(P＜0.05)。与文献报道基本一致[4]，但国外有相反结果报道[5]。提示P185蛋白表达可能是膀胱移行细胞癌早期表现。统计学分析表明：P185蛋白与预后无显著关系(P＞0.05)。

　　Soini等^［6］检测膀胱移行细胞癌中P53蛋白阳性表达随病理分级及临床分期增高而增高。我们的结果与其相一致，其中Ⅰ级阳性率13.8％,Ⅲ级阳性率41.2％，Tis-T1期阳性率12.5％，T3～4期41.2％。在分化差的膀胱癌中表达最强。P53蛋白阳性表达者局部淋巴结转移率高，死亡率高，预后差；阴性者则预后好。因此我们认为P53蛋白表达可作为判断膀胱癌恶性程度及预后的指标。

　　资料表明：膀胱移行细胞癌的发生、发展表现为多基因协同作用。叶定伟等^［7］报道了膀胱移行细胞癌中 ras和c-erb-2癌基因产物的表达。Lipponen^［8］报道了c-erb-2癌基因产物表达同时伴有P53蛋白表达。本研究检测3种基因蛋白的结果，说明多个基因协同激活在膀胱移行细胞癌发生、发展中起一定作用。

　　我们检测P53基因突变率为31.6％。其中全部有280密码子G-C突变。其中Ⅲ级及T3～4突变率高于Ⅰ、Ⅱ级和 tis-T1、T2(P＜0.01),与Fujimoto等^［9］的结构相一致.P53突变者死亡率高,预后差说明P53抑癌基因突变与膀胱癌的生物学行为密切相关。280密码子G-C突变是否热点突变还有待进一步研究。

　　作者简介：周占松(1965.6)，男，河北省饶阳县人，硕士，主治医师，主要从事膀胱癌的发病机制及治疗方面的研究，发表论文3篇。电话：(023)68752543作者单位：周占松(第三军医大学附属西南医院泌尿外科，重庆400038)

　　金锡御(第三军医大学附属西南医院泌尿外科，重庆400038)

　　宋波(第三军医大学附 属西南医院泌尿外科，重庆400038)

　　熊恩庆(第三军医大学附属西南医院泌尿外科，重庆400038)

　　参考文献

　　［1］Viola m V, Fromo Witz F, Oravez S, et al. Ras oncogene P21 expression is increased in premalignant lesions and high-grade bladder carcinoma［J］. j Exp Med,1985,161(5):2 113－2118.

　　［2］何兆伟，陆灿辉，申鹏飞，等.ras-P21和P53在膀胱癌表达的临床意义［J］.中华泌尿外科杂志，1996，17(1)：20－23.

　　［3］缪延杰，王泽.癌基因ras产物P21表达与膀胱癌生物学行为之间的关系［J］.临床泌尿外科杂志，1990，5(2)：156－158.

　　［4］邹文，吴明明，虞颂庭，等.膀胱癌原癌基因c-erb-2蛋白产物表达［J］.中华泌尿外科杂志，1995，16(2)：84－85.

　　［5］Sato k, Moriyama M, Mori S, et al. An immuno-histoloicale-valuation of c-erb-2 gene product in patient with urinary bladder carcinoma［J］. cancer,1992,70(10):2 493－2498.

　　［6］Soini y, Turpeenniemi-Hujanen T, Kamel D, et al. P53 immu-nohistochemistry in transitional cell carcinoma and dysplasia of the urinary bladder correlates with disease progression［J］. br J Can-cer,1993,68(5):1 029－1035.

　　［7］叶定伟，郑家富，钱松溪，等.P53基因突变与泌尿系肿瘤关系的初步研究［J］.中华医学杂志，1994，74(11)：656－658.

　　［8］Lipponen p K. Interrelationship between expression of P53 pro-liferation cell nuclear antigen and c-erb-2 in bladder cancer［J］.Pathology,1993,61(3～4):178－182.

　　［9］Fujimoto k, Yamada Y, Okajima E,et al. Frequent association of P53 gene mutation in invasive bladder cancer［J］. cancer Res, 1992,52(6):1 393－1398.