核酶对膀胱癌细胞系多药耐药性的逆转研究

　　第三军医大学学报2000年第22卷第1期

何斌　金锡御　杨唐俊　金欢胜　王祥卫　刘素英　曾毅

　　摘　要　目的：探讨核酶对膀胱癌多药耐药性的逆转效应。方法：设计针对mdr1mRNA1959位GUC的“锤头状”（Hammerhead）核酶（Ribozyme1，RZ1）基因，定点克隆于逆转录病毒载体pLXSN的BamHI和EcoRI位点上，重组出带有核酶基因的逆转录病毒质粒pLXSN-RZ1。应用脂质体DoTap将pLXSN-RZ1导入到耐药的人膀胱癌细胞系BHA-60细胞中。结果：导入pLXSN-RZ1的细胞系耐药性显著降低，RT-PCR结果显示，细胞内mdr1mRNA显著减少。结论：本研究中设计的核酶能明显逆转膀胱癌细胞系多药耐药性。

　　关键词：核酶；多药耐药；肿瘤

　　肿瘤细胞的多药耐药性（Multidrug resistance，MDR）是影响肿瘤化疗效果的重要因素，我们曾应用体外转录mdr1 mRNA的方法证明核酶能切割mdr1 mRNA^［1］，但是，由于细胞内mdr1 mRNA较体外转录的mdr1 mRNA长，结构也复杂得多，尚不能肯定所设计的核酶也能在细胞内切割mdr1 mRNA，所以，我们将带有核酶（RZ1）基因的重组逆转录病毒质粒导入到耐药的人膀胱癌细胞系BHA-60细胞中，检测所设计的核酶能否在细胞内切割mdr1 mRNA，观察它们对MDR的逆转效应。

　　1　材料和方法

　　1.1　细胞模型的建立

　　1.1.1　BIU-87　　人膀胱癌移行上皮细胞系，引自北京医科大学泌尿外科研究所^［2］。该细胞取材前及建株过程未接触任何抗癌药物。

　　1.1.2　BHA-60细胞　　为本实验室应用转基因方法建立的多药耐药细胞系^［3］。

　　1.2　主要试剂

　　质粒pLXSN：美国Miller教授惠赠，为逆转录病毒载体，在其多克隆位点上游含5’-LTR，在其多克隆位点下游含SV-40启动子和Neo基因。脂质体（DoTap）、TriPure^tmRNA提取试剂盒购自德国Boehringer mannheim公司。G418：美国Gibercol BRL公司产品，用20mmol/L的HEPES稀释成100μg/ml，0.2μm过滤器过滤除菌，分装后保存于－20℃备用。

　　1.3　方法

　　1.3.1　细胞培养　　细胞置于37℃，饱和湿度，含5％CO₂的孵箱中培养，培养液为含有10％新生小牛血清的RPMI1640。

　　1.3.2　核酶逆转录病毒载体的构建　　根据计算机模拟mdr1mRNA二级结构，设计并合成核酶基因。质粒pLXSN经BamHI和EcoRI双酶切，在T4DNA连接酶作用下完成连接反应，导入JM109大肠杆菌，筛选出重组克隆。

　　1.3.3　重组逆转录病毒质粒pLXSN-RZ1对耐药细胞BHA-60的转染　　按DoTap说明书操作。加入G418（终浓度为800μg/ml）选择培养，定期更换新鲜培养液，共选择培养14～16d，长出肉眼可见克隆。该细胞系命名为BHA-RZ1。

　　1.3.4　细胞对药物（阿霉素ADM、秋水仙素COL）半数抑制量（IC₅₀）的测定　　按文献［4］报道用MTT法测定。

　　lgIC₅₀=∑(X_i＋X_i＋1)(P_i＋1－P_i)/2

　　i为组号，X_i＋X_i＋1为相邻两组对数剂量之和，P_i＋1－P_i为相邻两组抑制率之差。

　　1.3.5　RT-PCR检测细胞内mdr1 mRNA的表达量　　按文献［5］进行。

　　1.4　统计学处理

　　取5次试验的平均值，所有数据以表示，两个样本比较用t检验。

　　2　结果

　　2.1　重组逆转录病毒载体pLXSN-RZ1的酶切鉴定

　　RZ1基因与pLXSN载体连接混合物,常规CaCl₂方法导入大肠杆菌JM109，得到2个转化子，提取质粒。经BamHI和EcoRI各酶切6h，然后加入等体积的甲酰胺，55℃×5min，8％PAGE-8M尿素，电泳结果见图1。双酶切后的片段长度为48bp。该逆转录病毒载体命名为pLXSN-RZ1。

图1　重组逆转录质粒pLXSN-RZ1的酶切分析(8％-PAGE)

　　fig1　Restrictive digestion analysis of pLXSN-RZ1

　　1:pLXSN-RZ1＋BamH I＋EcoR I

　　2:pGEM-7Zf(＋)/Hae Ⅲ marker

　　2.2　重组逆转录病毒质粒pLXSN-RZ1对BHA-60细胞的转染

　　加入DoTap及DNA混合液孵育后，未见细胞内出现异常颗粒或空泡化。加入G418后第2天即出现大量细胞死亡，第7天可见个别区域细胞呈岛状生长，细胞岛处细胞呈增生象，第11天散在的细胞几乎全部死亡（对照组细胞也全部死亡），细胞岛处细胞密度进一步增高。第14天时G418减少为600μg/ml，继续维持2d，然后G418减少为400μg/ml，维持1d后停用，说明pLXSN-RZ1已转染到BHA-60细胞内，该细胞命名为BHA-RZ1。

　　2.3　细胞系多药耐药性的测定

　　2.3.1　细胞对ADM的半数抑制量（IC₅₀）　　图2显示各细胞对ADM的IC₅₀值。BHA-RZ1与BHA-60细胞比较显著下降（P＜0.05），但高于BIU-87细胞的IC₅₀值。

图2　细胞对ADM的IC₅₀值

　　fig2　Value of cell IC₅₀ to ADM

　　2.3.2　细胞对COL的半数抑制量（IC₅₀）　　图3显示各细胞对COL的IC₅₀值，BHA-60是BIU-87细胞的5.3倍（P＜0.01），BHA-RZ1较BHA-60细胞显著下降（P＜0.01）。

图3　细胞对COL的IC₅₀值

　　fig3　Value of cell IC₅₀ to COL

　　2.4　RT-PCR检测细胞内mdr1mRNA表达

　　图4显示不同细胞在相同条件下RT-PCR的结果，β-actin作为内对照，在总RNA相同量的条件下β-actin的扩增条带基本相同（长度为587bp），mdr1157bp条带出现明显差异，以BHA-60细胞扩增条带最为明显，BHA-RZ1的扩增条带较BHA-60细胞弱。

图4　不同细胞RT-PCR结果（2％琼脂糖凝胶）

　　fig4　Agarose gel analysis of RT-PCR products for mdrl mRNA

　　1：pGEM-7zf(＋)/Hae Ⅱ marker

　　2：BIU-87 cells

　　3：BHA-60 cells

　　4：BHA-RZ1 cells

　　3　讨论

　　MDR的发生机制较多，目前认为P-GP是形成MDR的最主要机制。因此，有关MDR的逆转研究也主要集中于对这一机制上。最早人们试图用药物来逆转MDR，Tsuruo^［6］用非细胞抑制剂量的异博定（Verapemil，VPL）能明显降低肿瘤细胞对长春新碱（Vincristine，VCR）的耐药性。尽管很多药物都有不同程度的逆转MDR作用，但是这些药物均只是在较高浓度条件下才能发挥作用，由于毒副作用，临床上不可能达到如此高的血药浓度，使应用药物逆转MDR受到限制。随着P-GP机制的进一步明确以及mdr1基因的成功克隆，使得用转基因方法逆转MDR成为可能。Elsa等^［7］报道，化疗药物Rhadamine123（R-123）在正常人肾系膜细胞（Human mersangial cell，HMC）中的半衰期为(25±3)s，将人工合成的mdr1mRNA反义寡核苷酸（aODN）20μg/ml与HMC共同孵育3d，R-123在HMC中的半衰期延长达(304±53)s，aODN显著地减少了P-GP在细胞膜上的表达量。

　　近年来，核酶用于基因治疗已取得很大进展，特别是在AIDS研究中的成果更是让人们对基因治疗的前景充满信心。核酶用于MDR的逆转研究近年来才有报道。Kobayashi^［8］合成两个核酶基因，分别切割mdr1 mRNA 196位和179位密码子，将切割mdr1 mRNA 196位密码子的核酶构建于pHβAPr-1 neo载体上，电穿孔法导入到耐药的人急性淋巴母细胞白血病细胞系(Human acute lymphoblastic leukemia cell line)MOLT-3/TMQ800中，转染核酶后MOLT-3/TMQ800对VCR的耐药性由原来的700倍（与其母细胞MOLT-3比较）下降至20～30倍。我们应用体外转录mdr1 mRNA等方法也证明，在无细胞环境下，本实验室设计的针对mdr1 mRNA1959位GUC的RZ1对mdr1 mRNA的切割达90％^［1］。本研究进一步将RZ1基因构建于逆转逆转录病毒载体上，然后再导入到MDR细胞系BHA-60中，多药耐药性测定结果表明RZ1能显著逆转BHA-60细胞的耐药性。RT-PCR结果也显示，导入RZ1基因的细胞mdr1 mRNA水平较母细胞BHA-60细胞低,说明本研究中所构建的核酶基因能明显逆转膀胱癌细胞系的MDR。

　　但是，本研究所构建的核酶的逆转作用并不完全，我们认为可能与下列因素有关：①核酶与mdr1 mRNA比例不平衡。体外切割实验表明核酶与靶RNA比例是影响核酶切割活性的因素之一^［9］，mdr1 mRNA在BHA-60细胞中处于高表达状态，而直接用脂质体导入的核酶基因受限制，细胞内表达的核酶不足以完全切割mdr1 mRNA，因而转染核酶基因后的细胞仍具有一定的耐药性^［10］。②细胞内mdr1mRNA二、三级结构的变化影响核酶与靶RNA的结合，导致核酶活性下降。因此，如何更有效地应用核酶达到完全逆转MDR的作用，尚有待于进一步探讨。

　　基金项目：国家自然科学基金资助项目(39670824)

　　作者简介：何斌(1964.3)，男，安徽省贵池市人，博士，副主任医师，副教授，主要从事膀胱癌的基因治疗方面的研究，发表论文17篇。电话：(023)68755624何斌(第三军医大学：附属新桥医院泌尿外科，重庆　400037)

　　金锡御(附属西南医院泌尿外科，重庆　400038)

　　杨唐俊(第三军医大学：附属新桥医院泌尿外科，重庆　400037)

　　金欢胜(第三军医大学：附属新桥医院泌尿外科，重庆　400037)

　　王祥卫(第三军医大学：附属新桥医院泌尿外科，重庆　400037)

　　刘素英(第三军医大学：附属新桥医院泌尿外科，重庆　400037)

　　曾毅(第三军医大学：附属新桥医院泌尿外科，重庆　400037)

　　参考文献

　　［1］何斌，金锡御，杨唐俊，等.核酶对mdr1mRNA的体外切割［J］.中华泌尿外科杂志，1998，19（4）：195－198.

　　［2］俞莉章，黄雅丽，顾方六，等.人膀胱癌细胞系BIU87的建立及其生物学特征［J］.中华泌尿外科杂志，1989，10（3）：131－133.

　　［3］何斌，金锡御，杨唐俊，等.转基因方法建立一种新的多药耐药细胞系［J］.中华泌尿外科杂志，1999，20（7）：403－405.

　　［4］陈鹏，刘叙仪，赫复生.耐顺铂人肺腺癌细胞系A549/cDDP的建立及耐药机制［J］.中国肿瘤临床，1995，22（8）：582－587.

　　［5］Noonan K E,Beck D,Holzmayer T A.Quantitative analysis of MDR1(multidrug resistance) gene expression in human tumors by polymerase chain reaction［J］.Proc natl Acad Sci USA,1990，87(18):7160－7164.

　　［6］Tsuruo T,Lida H,Tsukagoshi S,et al.Overcoming of VCR resistance in P338 leukemia in vivo and in vitro through enhanced cytotoxicity of VCR and VDS by vPL［J］.Cancer Res,1981，41(5):1967－1972.

　　［7］Elsa B R,Ernest S.Expression and function of P-glycoprotein in human mesangial cells［J］.Am J Physiol,1994，267(5):C1351－1358.

　　［8］Kobayashi H,Dorai T,Holland J F,et al.Reversals of drug sensitivity in multidrug-resistant tumor cells by an MDR1(PGY1) ribozyme［J］.Cancer Res,1994，54(5):1271－1275.

　　［9］Bertrand E,Pictet R,Grange T,et al.Can hammerhead ribozymes be efficient tools to inactivate gene function［J］? Nucleic Acids Res,1994，22(3):293－300.

　　［10］Scanlon K J,Ishida H,Kashani-Sabet M.Ribozyme-mediated reversal of the multidrug-resistant phenotype(drug resistance/ovarian carcinoma)［J］.Proc natl Acad Sci USA,1994，91(23):11123－11127.