膀胱癌谷胱甘肽转移酶π的免疫电镜定位

中华泌尿外科杂志 1998年第7期第19卷 论　　著

作者：陈明　眭元庚　尤国才　徐正铨　冯善章

单位：210008　南京大学医学院附属鼓楼医院泌尿外科(陈明)；南京医科大学第一附属医院泌尿外科(眭元庚、尤国才、徐正铨、冯善章)

　　关键词： 膀胱肿瘤；癌；谷胱甘肽转移酶π

　　摘要　为探讨膀胱癌的耐药机制，应用抗谷胱甘肽转移酶π(GST_π)抗体和免疫胶体金方法对3例膀胱移行细胞癌(TCC)、3例癌旁组织和3例正常膀胱粘膜细胞内进行GST_π的定位。结果显示：TCC中GST_π胶体金颗粒主要分布在癌细胞的线粒体、溶酶体、粗面内质网、核内(常染色体内分布为主)及核膜上，3例正常膀胱粘膜中1例在胞浆中有少量的GST_π胶体金颗粒分布，其余2例及3例癌旁组织则均未见胶体金颗粒。结果表明：GST_π在膀胱癌耐药中可能起重要作用，GST_π在膀胱癌细胞超微结构中异常表达反映出GST_π在这些癌细胞内处于应激状态。

　　Localization of Glutathione S-transferase π in human bladder neoplasmas 　Chen Ming, Sui Yuangeng, You Guocai, et al. Department of Urology, Drum Tower Hospital Affiliated to Medical College of Nanjing University, Nanjing 210008

　　Abstract　To study the mechanisms of drug resistance in bladder cancer, localization of glutathione S-transferase π(GST_π) in cells was determined in 3 bladder cancers, 3 paratumor tissues and 3 normal bladder mucosas by colloid gold immunoelectron microscopy using anti-GST_π antibody. GST_π colloid gold particles in bladder cancer cells were mainly located in mitochondria, lysosome, rough endoplasmic reticulum, nucleus(mainly in enchromation) and nuclear mucosa. GST_π colloid gold particale was positive (mainly in cell plasma) in only 1 of the 3 normal bladder mucosa and the 3 paratumor tissues were all negative. The results indicated that the resistance of chemotheraputic drug in bladder tumors might be related to the expression of GST_π. The expression of GST_π in the ultrastructure of bladder cancer cells showed that GST_π in bladder cancer being in stress state.

　　Key words　Bladder neoplasms　　Carcinoma　　Gultathione S-transferase π

　　多药耐药(MDR)是肿瘤耐药的重要形式，是导致肿瘤化疗失败的重要原因。目前除发现肿瘤病人的MDR与mdr₁基因家族的活性增强及其编码的P-糖蛋白(P-gp)超表达外，还发现MDR与谷胱甘肽转移酶的同功酶也有密切的关联^［1］。为了进一步研究GST_π在膀胱癌中的表达，我们采用免疫胶体金标记技术对GST_π的抗原进行超微结构上的定位，以探讨GST_π在膀胱癌耐药中的作用。

　　材料与方法

　　一、标本来源

　　3例膀胱癌和3例癌旁组织均为住院病人行开放手术切除的新鲜肿瘤标本，经病理证实为膀胱移行细胞癌，3例正常对照取材于2例猝死病人和1例BPH手术病人的正常膀胱粘膜。

　　二、实验材料

　　GST_π鼠抗人单克隆抗体为DAKO公司产品，免疫电镜用的胶体金标志的羊抗鼠IgG购于武汉博士德生物工程公司。

　　三、透射电镜样品制备及免疫胶体金标记

　　新鲜标本经3%多聚甲醛室温固定后，常规酒精、丙酮梯度脱水，Epon812浸透和包埋，用镍网制成600A的超薄切片^［2］。

　　超薄切片依次经H₂O₂双蒸水及TBS处理后，用正常小牛血清阻断非特异性吸附；滴加抗GST_π单克隆抗体(1∶10稀释)4℃20小时加至室温2小时，再经TBS pH7.4清洗后，用胶体金标记羊抗鼠IgG(GAMG5， 1∶10稀释)，室温孵育2小时，经pH7.4 TBS浸洗；用醋酸铀饱和液对照染色，枸橼酸铅对照染色后用透射电镜观察结果，空白对照以pH7.4 TBS替代一抗。

　　结　　果

　　透射电镜下观察正常组织及膀胱移行细胞癌和癌旁组织的GST_π免疫胶体金标记，3例膀胱移行细胞癌组织中标记阳性细胞金颗粒主要分布在细胞浆中，在线粒体、溶酶体、粗面内质网及滑面内质网内均有分布(图1)，其中1例T₃期膀胱癌除胞浆外还可见胞核常染色质及核膜上均有GST_π胶体金颗粒(图2)，3例癌旁组织均为阴性。

　　3例正常膀胱粘膜中仅有1例取材于BPH手术者在胞浆中有少量的GST_π胶体金颗粒，胶体金颗粒明显少于肿瘤组织，且不局限于某一特定的细胞器，胞核中未见有阳性胶体金颗粒(图3)。

　　讨　　论

　　一、GST_π的临床意义

　　谷胱甘肽转移酶可分为5种基因家族，有4种在胞浆中为α、μ、π和θ，另一种为结合于胞膜的微粒体GST^［3］。GST不仅可以催化亲电物质与谷胱甘肽相结合，而且GST本身还可以与亲脂性细胞毒药物结合增加其水溶性，促进其排泄，降低抗肿瘤药物的细胞毒作用，保护细胞免受细胞毒药物的损害。研究发现在一些难治性肿瘤中GSTs活性比正常组织明显升高，

图1　膀胱癌组织胞浆内可见胶体金颗粒

图2　膀胱癌(PT₃)核膜及胞浆内可见胶体金颗粒

图3　BPH病人膀胱组织胞浆内可见胶体金颗粒

　　认为GSTs浓度升高可以部分说明许多人类肿瘤的先天性耐药，在膀胱组织中整个GSTs中90%以上是GST_π^［4］。GST_π的浓度在大部分肿瘤中比正常组织要高80%。在肾脏、肾上腺、睾丸等器官及相应的肿瘤中均有GST_π的表达。

　　GST_π的高表达与许多肿瘤对化疗耐药有关。Katagiri等^［5］运用Western blot分析法发现睾丸肿瘤中GST_π的表达与其对化疗药物敏感性呈负相关。用基因转移技术把GST cDNA转移到敏感细胞后，可以提高细胞对特异性药物的耐受能力^［6］。Lafuente等^［7］检测膀胱移行细胞癌，发现GSH含量及GST活性较正常对照明显增高。Thomas等^［8］运用免疫组化技术对49例膀胱移行细胞癌研究，发现在胞浆中均可见有GST_π表达，部分浸润型膀胱癌同时可见胞核染色。本实验中3例膀胱癌和1例正常粘膜胞浆中可见GST_π胶体金颗粒，而且膀胱癌中胶体金颗粒明显多于正常膀胱粘膜，推测膀胱癌中GST_π的高表达在其化疗耐药中可能起重要作用。

　　二、膀胱癌GST_π超微结构定位

　　本实验在亚细胞水平上对膀胱癌、癌旁组织及正常粘膜内胶体金标记的GST_π进行定位研究，结果表明胶体金颗粒主要分布于膀胱癌细胞的胞浆内、线粒体、粗面内质网、溶酶体，这些部位是正常细胞解毒功能的主要场所，这种功能可能使膀胱移行细胞癌对外源性化疗药物有积极的防御功能，是膀胱癌化疗耐药的重要原因之一。

　　本组1例T₃膀胱移行细胞癌胶体金颗粒除了分布在癌细胞胞浆中，还在胞核及核膜上可见有较多的GST_π分布。胞核内以常染色质为主，一般认为常染色质中DNA代谢活跃，膀胱癌中核膜及常染色质上GST_π胶体金颗粒的临床意义尚待进一步研究。以往研究在临床分期较高的膀胱癌中可见GST_π的核染色，认为核染色可能与膀胱癌进展有关^［8，9］。可以设想，GST_π在细胞内设置了两个屏障，一层位于胞质内作为外周屏障，另一层位于细胞核周边，共同解除来自胞浆中毒性物质的毒性，从而保护细胞中DNA免受损伤。这可能是临床分期较高的膀胱癌对化疗药物不敏感的因素之一。

　　3例正常粘膜中1例取材于BPH手术者可见胞浆中有GST_π胶体金颗粒，并不局限于某一特定的细胞器，且数量明显较膀胱癌要少，提示正常膀胱粘膜对化疗药物有一定的抗药性，对维持正常的细胞功能有一定的作用。

　　总之，通过对膀胱癌亚细胞水平上GST_π的定位研究，可以对膀胱癌的化疗用药有一定的指导作用，同时为逆转肿瘤耐药的GST抑制剂如利尿酸(EA)等的临床应用提供实验依据。

　　参　考　文　献

　　1　Harrisson DJ. Molecular mechanisms of drug resistance in tumors. J Pathol, 1995,175∶7-12.

　　2　张学敏，杨怡，李春海，等.肺癌组织细胞胎盘型谷胱甘肽 S-转移酶的免疫电镜定位.中华医学杂志，1992，72∶294.

　　3　Mannervik B, Awasthi YC, Board Pg, et al. Nomenclature for human glutathione transferase. Biochem J, 1992,282∶305-308.

　　4　Singh SV, Roberts B, Gudi VA, et al. Immunohistochemical localization, purification and characterization of human urinary bladder glutathione S-transferase. Biochem Biophs Acta, 1991,1074∶363-367.

　　5　Katagiri A, Tomita Y, Nishiyama T, et al. Immunohistochemical detection of P-glycoprotein and GST P₁-1 in testis cancer. Br J Cancer, 1993,68∶125-129.

　　6　Ban N, Takahashi Y, Takayama T, et al. Transfection of glutathione S-transferase Pi antisense complementary DNA increase the sensitivity of a colon cancer cell line to adriamycin, cisplatin, melphalan and etoposlad. Cancer Res, 1996,56∶3577-3580.

　　7　Lafuente A, Giralt M, Cervello I, et al. Glutathione S-transferase activity in human superficial transitional cell carcinoma of the bladder, comparison with healthy controls. Cancer, 1990,65∶2064-2068.

　　8　Thomas DJ, Birch PJ, Vickers J, et al. Glutathione S-transferase Pi expression in transitional cell carcinoma of the bladder. Br J Urol, 1993,72∶740-743.

　　9　陈明，眭元庚，尤国才，等.膀胱癌谷胱甘肽转移酶Pi的表达及其临床意义.中华泌尿外科杂志，1997，18∶478-481

(收稿：1997-07-31)