膀胱癌尿脱落细胞端粒酶活性检测及其临床意义

中华泌尿外科杂志 1999年第5期第20卷 论　著

作者：王翔　张元芳　叶烈夫　丁强　瞿连喜

单位：200040　上海医科大学泌尿外科研究所,华山医院泌尿外科

　　关键词： 膀胱肿瘤,癌,端粒酶活性

　　【摘要】　目的　检测尿脱落细胞端粒酶活性并探讨其临床意义。　方法　应用改良的端粒重复序列扩增(TRAP)-银染方法，分别对膀胱癌组织、正常膀胱组织，以及膀胱癌患者和非尿路上皮肿瘤患者的尿脱落细胞、膀胱冲洗液进行端粒酶活性检测。　结果　12例正常膀胱组织均无端粒酶活性，48例膀胱癌组织中44例(91.7%)端粒酶阳性。膀胱癌患者尿液及膀胱冲洗液中脱落细胞端粒酶阳性率分别为83.3%(40/48)和87.5%(42/48)。12例分化良好(G₁级)膀胱癌患者中，尿液和膀胱冲洗液中脱落细胞端粒酶阳性率分别为75.0%(9/12)和83.3%(10/12)。　结论　尿脱落细胞端粒酶活性检测敏感性高，可用于膀胱癌的早期诊断和术后随访。

　　Telomerase activity in exfoliated urothelial cells of bladder cancer　WANG xiang,ZHANG Yuanfang,YE Liefu,et al.Department of Urology,Huashan Hospital,Institute of Urology,Shanghai medical University,Shanghai 200040

　　【Abstract】　Objective　To study the telomerase activity in exfoliated urothelial cells of bladder cancer and to evaluate its clinical significance.　Methods　Telomerase activity was studied by means of a modified PCR-based telomeric repeat amplification (TRAP)-silver stain assay in tissue and urine samples and bladder washings from 48 cases of bladder cancer and 12 normal bladder and in urine samples and bladder washings from 20 patients with non-urothelial cancer.　Results　Telomerase activity was detected in 44 of the 48 tumor samples(91.7%)while none of the normal bladder tissue showed telomerase activity.Telomerase activity was also detected in 83.3%(40/48)of urine samples and 87.5%(42/48)of bladder washings from bladder cancer patients.In 12 patients with well diffentiated bladder cancer (G₁),telomerase activity was detected in 9 urine samples(75.0%)and in 10 bladder washings(83.3%).　Conclusions　Telomerase activity could be detected in most urine samples of bladder cancer patients and therefore would be a good diagnostic marker.But it is not related to the tumor grade or stage.

　　【Key words】　Bladder neoplasms,Carcinoma,Telomerase activity

　　端粒酶的激活与肿瘤的发生发展密切相关，绝大部分正常人体细胞中没有端粒酶活性，而在肿瘤细胞中端粒酶却特异性地表达^［1，2］。我们应用多聚酶链反应(PCR)为基础改良的端粒重复片段扩增(TRAP)-银染的方法检测膀胱癌患者尿液和膀胱冲洗液中脱落细胞端粒酶活性，并探讨其在膀胱癌早期诊断中的临床意义。

　　材料与方法

　　一、临床资料

　　48例膀胱移行细胞癌患者均经病理证实。年龄45～87岁，平均64岁。男39例，女9例。20例非泌尿系肿瘤血尿患者为对照组。年龄43～82岁，平均61岁。男14例，女6例。48例膀胱移行细胞癌按UICC和WHO评定标准，G₁、G₂、G₃肿瘤分别为12例、25例、11例；PTis、PTa、PT₁、PT₂、PT_3～4期肿瘤分别为2例、5例、18例、15例和8例。

　　二、标本收集与处理

　　分别取膀胱癌患者和对照组人的清晨新鲜尿液100ml,立即低温离心(4℃,600×g，5分钟),移去上清液，将沉淀物用10ml pBS洗涤后，再次离心，并将沉淀物转至1.5ml EP管于-80℃保存待测端粒酶活性。48例膀胱癌患者术前经导尿管或通过膀胱镜以100ml冷生理盐水冲洗膀胱5次，冲洗液处理同上。48例膀胱癌患者术中取小块癌组织，并取其中12例正常部位膀胱组织，-80℃保存待测端粒酶活性。

　　三、端粒酶提取

　　取每例尿脱落细胞沉淀物或30mg液氮中研碎的膀胱癌组织，分别加入20μl、100μl cHAPS裂解液，混匀后0℃放置30分钟，1 200×g 4℃离心20分钟，吸取上清液。采用BSA试剂盒进行蛋白含量测定后，稀释为0.5μg/μl，分装存于-80℃。

　　四、端粒酶活性测定

　　根据Kim等^［3］的端粒重复片段扩增方法(TRAP)检测端粒酶活性，并加以改进。TRAP-EZE^TM购自Oncor公司。反应体积25μl，反应体系含20mmol/L tris-HCl(pH8.3),1.5mmol/L MgCl,63mmol/L KCl,0.05% Tween-20,1mmol/L EGTA,0.1μg/ml bSA,0.25mmol/L dNTP,TS引物(5′-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3′),CX引物(5′-CCCTTACCCTTACCCTTACCCTAA-3′),内对照K1引物和TSK1模版，2U taq DNA 聚合酶，1μl上述端粒酶提取液。混匀后置30℃温育30分钟，进行引物延伸。PCR扩增延伸产物，94℃30秒、55℃　30秒,循环32次。将反应产物在12.5%非变性聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳，电泳缓冲液为0.5×TBE,350V电泳60分钟，银染显色。端粒酶阳性表达者出现从50 bp开始的间隔6 bp的梯形条带图象，阴性表达者仅出现一条36bp内对照条带(图1)。

　　图1　膀胱癌患者尿脱落细胞端粒酶活性检测TRAP-银染结果1.Marker(pBR322-HaeⅢ)DNA相对分子质量标准；2.端粒酶阳性的Hela细胞作阳性对照；3.裂解缓冲液作阴性对照；4-5.表达端粒酶活性的膀胱癌患者尿脱落细胞

　　结　果

　　一、膀胱癌组织及正常膀胱组织端粒酶活性

　　48例膀胱癌组织中，44例(91.7%)端粒酶检测阳性。正常膀胱组织端粒酶均为阴性。根据细胞分化程度，G₁、G₂和G₃级膀胱癌端粒酶阳性率分别为91.7%(11/12)、92.0%(23/25)和90.9%(10/11)。端粒酶活性与肿瘤的分级、分期差异无显著性(P＞0.05)，即使分化好的早期膀胱癌也呈现较高的端粒酶阳性率。

　　二、尿脱落细胞端粒酶活性

　　1.膀胱癌患者尿脱落细胞端粒酶活性表达：48例膀胱癌患者尿液和膀胱冲洗液中脱落细胞端粒酶阳性率分别为83.3%(40/48)和87.5%(42/48)。在8例自然排尿尿脱落细胞端粒酶阴性患者中，2例膀胱冲洗液脱落细胞端粒酶阳性。12例G₁患者，尿液和膀胱冲洗液端粒酶阳性率分别为75.0%(9/12)和83.3%(10/12)。

　　2.对照组端粒酶活性表达：对照组20例中，3例显示较弱的端粒酶活性，其中1例为腺性膀胱炎，另2例分别为膀胱结石和良性前列腺增生伴有尿路感染。后2例在去除病因并彻底控制尿路感染后，尿脱落细胞端粒酶活性均转为阴性。

　　讨　论

　　自1994年Kim等^［3］建立TRAP方法以来，人们已对人多种肿瘤及正常组织端粒酶活性进行了检测，除生殖细胞和部分造血干细胞外，端粒酶活性主要特异性出现于恶性肿瘤组织，而在正常体细胞内无活性表达^［4］。我们应用改良的非放射性TRAP-银染方法对48例膀胱癌组织和12例正常膀胱组织的端粒酶活性进行检测，发现该方法与用放射性同位素检测相比，不仅简便、安全、省时，而且敏感度也较溴化乙锭染色高5～10倍^［5］。本研究结果显示，48例膀胱癌组织中44例(91.7%)端粒酶活性表达阳性，而正常膀胱组织均为阴性，端粒酶活性与肿瘤的分级、分期无明显相关性，即使分化好的早期膀胱癌也呈现较高的端粒酶阳性率，由此提示检测尿脱落细胞端粒酶活性对早期膀胱癌的诊断有一定的临床意义。

　　端粒酶是一种RNA逆转录酶，在脱落的癌细胞中容易降解。关于尿脱落细胞端粒酶活性检测的报道结果各不相同。Muller等^［6］曾认为，正常排尿的膀胱癌尿脱落细胞由于端粒酶活性的降解而无法测得，仅在膀胱冲洗液中可测得端粒酶活性，但Kavaler等^［7］在膀胱癌患者尿脱落细胞中成功测得了端粒酶活性。我们应用改良的TRAP-银染方法检测48例膀胱癌患者尿液和膀胱冲洗液脱落细胞端粒酶活性的阳性率分别为83.3%(40/48)和87.5%(42/48)，尿脱落细胞端粒酶活性阳性率与Kavaler等^［7］报道的阳性率85%基本相同。48例膀胱癌患者中8例尿脱落细胞端粒酶活性为阴性，分析原因如下：(1)肿瘤本身无端粒酶活性表达，可能通过其它替代途径维持端粒长度^［8］；(2)标本中存在RNA酶，影响端粒酶活性检测；(3)脱落癌细胞数目过少或标本处理不及时不得当，肿瘤细胞裂解或端粒酶活性降解。我们体会：尿液的迅速低温处理保存以及容器预先用RNA酶处理，对防止端粒酶的降解极为重要；而检测方法的改进则进一步提高其敏感性。为避免膀胱癌脱落细胞端粒酶活性降解，建议取患者清晨新鲜尿液并立即低温离心。

　　本研究中，8例尿脱落细胞端粒酶表达阴性患者，通过膀胱冲洗，2例测得脱落细胞端粒酶活性，表明膀胱冲洗可提高检测敏感性，尤其适于分化较好、肿瘤细胞不易脱落的患者，并适于在膀胱镜检查或术后膀胱药物灌注时使用。

　　12例G₁膀胱癌患者中，尿液和膀胱冲洗液中脱落细胞端粒酶阳性率分别为75.0%(9/12)和83.3%(10/12)，与文献报告的传统尿脱落细胞检查结果相比，敏感性大大提高。此外，尿脱落细胞端粒酶活性检测对非外生型膀胱肿瘤如原位癌也显示出较高的敏感性，从而也可弥补膀胱镜检查的不足之处。

　　在20例对照组中，有3例出现假阳性结果，其中1例为腺性膀胱炎，另2例均有继发性尿路感染。可能与外周血中的白细胞、淋巴细胞有较弱的端粒酶活性表达有关^［3］。因而认为，尿路感染可能是造成假阳性结果的主要原因，在检测尿脱落细胞端粒酶活性前，控制尿路感染很有必要。

　　*本课题受卫生部临床学科重点建设项目资助(60-152)

　　参考文献

　　1　Shay JW, Bacchetti S. A survey of telomerase activity in human cancer. Eur J cancer, 1997, 33∶787-791.

　　2　Hiyama E, Gollahon L, Kataoka T, et al. Telomerase activity in human breast tumors. J Natl Cancer Inst, 1996, 88∶116-122.

　　3　Kim NW, Piatyszek MA, Prowse KR, et al. Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer. Science, 1994,266∶2011-2015.

　　4　Wiener HG, Mian CH, Haitel A, et al. Can urine bound diagnostic tests replace cytoscopy in the management of bladder cancer? J Urol, 1997,159∶1876-1880.

　　5　Spagnolo DV, Turbett GR, Dix B, et al. Polymerase chain reaction and single-strand conformation polymorphism analysis (PCR-SSCP): a novel means of detecting DNA mutation. Adv Anat Pathol, 1994, 2∶61-65.

　　6　Muller M, Heine B, Heicappell R, et al. Telomerase activity in bladder cancer, bladder washings and in urine. Int J Oncol, 1996, 9∶1169-1173.

　　7　Kavaler E, Landman J, Chang Y, et al. Detecting human bladder carcinoma cells in voided urine samples by assaying for the presence of telomerase activity. Cancer, 1998, 82∶708-714.

　　8　Bryan TM, Englezou A, Gupta J, et al. Telomere elongation in immortal human cells without detectable telomerase activity. EBMO J, 1995, 14∶4240-4248.

(收稿：1998-10-29　修回：1999-02-05)