微卫星分析在中国人膀胱癌诊断中的应用
癌症 2000年第6期第19卷 快速报道
作者：张建军 范振斌 白瑾峰 萧泽钧 安倩 高燕宁 程书钧
单位：张建军 范振斌 白瑾峰 萧泽钧 安倩 高燕宁 程书钧（中国医学科学院中国协和医科大学肿瘤医院肿瘤研究所,北京100021）
关键词：微卫星；膀胱肿瘤；诊断；人种差异
【摘要】目的:探讨尿沉渣DNA微卫星分析方法在中国人膀胱癌诊断中的应用价值。方法:首先选取分布于18条染色体上的60个微卫星位点对38例膀胱肿瘤病人的尿沉渣和相应病理组织的DNA进行微卫星分析，寻找覆盖病人最多的位点组合;然后以此组合对40例膀胱疾病病人和健康志愿者的尿沉渣进行了双盲分析,以验证此组合的特异性和可能的临床价值。结果:建立了一套由9个微卫星位点组成的诊断组合。59例膀胱癌中，86％（31/36）的癌组织和90％（53/59）的尿沉渣DNA在这9个位点中至少有一个位点发生异常；12例非膀胱肿瘤个体的尿沉渣DNA无一例发生改变；检出率与肿瘤分期、分级无相关性；而且，该组合与美国人报道的组合明显不同。结论:作为一种无创伤性手段，尿沉渣DNA微卫星分析对于膀胱癌的筛查和早期诊断具有一定意义；与美国报道的诊断组合的不同，反映了人种差异和可能的病因学差异。
中图分类号:R730.43;R737.14 文献标识码:A
文章编号:1000－467X(2000)06－0512－05
Potential of microsatellite analysis in detection of
bladder cancer in the Chinese
ZHANG Jian－jun， FAN Zhen－bin, CHENG Shu－jun, et al.
Cancer Institute (Hospital), Chinese Academy of Medical Sciences and
Peking Union Medical College, Beijing 100021, P.R.China
【 Abstract】 Objectives: To investigate microsatellite analysis of urine sediments and find the potential for using it in diagnosis of bladder cancer in the Chinese. Methods: Sixty microsatellites markers from 18 chromosomes were first tested in a penal of 38 bladder tumors and corresponding urine specimens. The markers with high informative rates and frequent alterations were finally selected to set up the diagnostic panel. The same study was performed on urine DNA from 40 individuals with or without bladder lesions in a blinded fashion to test the specificity and the possible clinical value of this method. Results: A panel consisting of 9 microsatellites for diagnosis was set up. Among the 59 cases of bladder cancer, 86％ (31/36) of tumor tissues DNA and 90％ (53/59) of urine sediments DNA showed alterations, at least, in one of the nine microsatellite markers, while the 12 non bladder cancer individuals had no changes at any of these loci. The result was not associated with grade or stage of the tumor. Notably, this panel is mostly different from that used for the American patients. Conclusions: Microsatellite analysis of urine is a usable non invasive method for early detection of bladder cancer in the Chinese. The distinction between this panel and that of American implied racial and possible etiological differences.
Key words: Microsatellite; Bladder neoplasms; Diagnosis;Racial difference
膀胱癌是最常见的恶性肿瘤之一，在中国其发病率占泌尿系恶性肿瘤的首位[1]。膀胱镜检查能在直视下进行可疑病变的活检，是目前诊断膀胱癌的基本手段。然而，膀胱镜检查不仅是一种创伤性诊断方法，而且对设备技术要求较高，因此，限制了它在早期诊断和普查中的应用。有研究表明，尿中癌细胞的出现可能早于膀胱镜观察到的病变，而且由于癌细胞较正常细胞易于脱落，尿脱落细胞中有95％为癌细胞[2]，这使得用尿沉渣分析诊断膀胱癌成为可能。尿脱落细胞学检查是膀胱癌无创性诊断最常用的手段，但其敏感性较低，很容易漏诊，对于分化差的肿瘤敏感性为60％左右，对于分化良好的肿瘤则不足20％[2]。
图1 微卫星电泳代表图片
N：淋巴细胞，即正常对照；U：尿标本；T：病理组织。箭头标明杂合性缺失（LossofHeterozygosity,LOH）的等位基因；星号标明肿瘤病人的尿沉渣中出现的新带，即移位（Shift）。病例6的肿瘤组织在D18S472位点有明显的杂合性缺失，而其尿沉渣在此位点却无异常。
肿瘤的发生、发展是一个多阶段、涉及多种遗传变异的过程。微卫星的不稳定和杂合性缺失是肿瘤的常见现象。DNA微卫星序列短，便于PCR扩增，而且与特定肿瘤有着良好的相关性，因而受到人们的关注。已有充分证据表明微卫星是检测肿瘤临床标本很有价值的标记物。Sidransky等报道，在头颈鳞癌病人的唾液，肺癌病人的痰中可以检查到微卫星的改变。Nawroz、Cespedes则分别用血清中DNA的微卫星分析检测出部分头颈鳞癌和非小细胞肺癌病人[3，4]。Mao等通过尿液中脱落细胞的微卫星分析，对90％以上的早期膀胱癌病人及术后复发病人做出诊断，其中对部分病人的诊断比膀胱镜检提早了几个月[5]。为探讨尿沉渣微卫星分析在中国人膀胱癌诊断中的可能价值，我们进行了研究。
1 材料与方法
1.1 临床资料和标本收集
本组66例膀胱肿瘤病人均为中国医学科学院肿瘤医院泌尿外科住院病人。非膀胱肿瘤组12人，5人为健康成人志愿者，6人为膀胱良性病变患者，另有1例肺癌病人，临床资料见表1及表2。各病例均有病理检查确诊。分别收集膀胱肿瘤病人的新鲜病理组织，膀胱肿瘤病人及非膀胱肿瘤个体的外周血、晨尿（膀胱镜检查前或检查后两周取尿），离心分离外周血淋巴细胞及尿沉渣细胞，－80℃冻存备用。
1.2 DNA制备
以酚－氯仿法常规制备上述各类标本的基因组DNA。用显微切割法纯化9例病人（见表1中＊）相应石蜡切片的肿瘤组织并制备DNA，方法参见文献[6]。
1.3 微卫星扩增及结果分析
方法参见文献[5]，代表图片见图1。
2 结果与讨论
首先，我们采用Mao等报道的13个微卫星位点[5]对36例膀胱癌病人、2例内翻性乳头瘤病人的肿瘤组织和相应尿沉渣的DNA进行微卫星分析。结果除少数位点有一定比例异常外，多数位点在所研究的人群中因杂合度低或发生异常的病例少而不适于做诊断标记。利用Mao等报道的位点组合仅能对不到50％的病例做出诊断，与国外的报道相去甚远（资料未显示）。
此后，我们把研究范围扩大到18条染色体上的60个微卫星位点，经过筛选，最终建立了一套9个位点的组合（见表1、2）。36例膀胱癌中，86％（31/36）的癌组织DNA和86％（31/36）的尿沉渣DNA在这9个位点中至少有一个位点发生异常；2例内翻性乳头瘤中，有1例的瘤组织和尿沉渣检测到异常（见表1）。
表1 回顾研究的临床资料及微卫星分析结果
注：病例序号表示实验顺序。标＊的病例的手术切除组织在我们所选的60个微卫星位点均无改变，为排除正常组织混杂，我们对其石蜡切片进行了显微切割纯化肿瘤组织并制备DNA，进行微卫星分析。表中结果为显微切割后的分析结果。NA:不能实施;ND:未做;U:尿；T：组织；NI：无信息；●：杂合性缺失（LOH）；★：移位（Shift）。－：杂合性保留（Retention）。
表2 双盲研究的临床资料及微卫星分析结果
注：病例序号表示实验顺序。NA:不能实施;ND:未做;U:尿；T：组织；NI：无信息；●：杂合性缺失（LOH）；★：移位（Shift）。－：杂合性保留（Retention）。 为进一步探讨该位点组合的特异性和在临床诊断中的实用价值，我们又对40例膀胱疾病和健康志愿者的尿沉渣DNA进行了微卫星双盲分析（见表2）。结果在23例膀胱癌中有22例（96％）的尿沉渣中检测到异常，3例内翻性乳头瘤病人的尿液也发现有微卫星改变，在脂肪瘤、神经纤维瘤和12例非膀胱肿瘤个体尿沉渣中未检测到改变（见表2）。至此，在进行了尿沉渣微卫星分析的59例膀胱癌中，90％（53/59）的病例可被此位点组合检测出阳性结果，12例非膀胱肿瘤个体则无一查到异常改变（见表1、表2）。这表明尿沉渣DNA微卫星分析敏感、特异，对于膀胱癌的诊断具有实际应用价值。另外，此位点组合对于较常见的膀胱内翻性乳头瘤也有一定诊断价值。而对于神经纤维瘤和脂肪瘤等其它少见的膀胱肿瘤，由于病例数较少，尚难定论。
在同时进行了尿沉渣细胞学和微卫星分析的48例膀胱癌中，微卫星检出的阳性率为88％（42/48），远远优于细胞学（50％，24/48）；且细胞学所检出的主要是中晚期（pT2pT4）病例，而微卫星分析的检出率与分期分级无关（见表1、2），这表明微卫星分析对早期膀胱癌（pTapT1）的诊断更具优势。然而这并不意味着尿沉渣微卫星分析可以取代细胞学检查，两者应该有机结合，相互补充。例如：病例35、38、47，尿沉渣微卫星分析未测出异常，而细胞学检查却找到了癌细胞。这固然有取材和计算方法的影响（细胞学是多次取尿检查，有一次阳性便记作阳性；而尿沉渣微卫星分析只取一次尿进行分析），但更重要的还是由两者各自的特点决定。尿沉渣微卫星分析是一种基于肿瘤DNA异常的分析方法，它必然要受到所选择位点的限制，并受到标本中正常组织含量的影响。例如，在有严重血尿的病例38中，肿瘤组织查出多个微卫星位点的异常，尿中却均为阴性，这可能由于血尿中淋巴细胞过多，掩盖了肿瘤细胞的异常。再如，病例35是一例鳞癌，尿和癌组织中都检测不到微卫星的异常，可能是由于其遗传学异常超出了我们所选择的位点范围。而尿沉渣细胞学是基于形态学异常的方法，其优势在于在众多细胞中找到一个癌细胞便能对临床诊断提供支持，这是它能对病例35、38做出诊断的的原因。当然，对于多数病例来说，由于肿瘤细胞生长迅速、粘附性降低，而较正常上皮更易于脱落和贮存于膀胱中[2,5]，再加上微卫星分析的灵敏度高，膀胱癌病人尿沉渣中的肿瘤细胞数足以满足微卫星检测的要求。
正常组织混杂的干扰也存在于肿瘤手术标本中，在我们分析的38例膀胱肿瘤病理组织中，有9例在我们所测试的60个位点中无一发生改变（资料未示），而其中的3例(病例2、4、38)经显微切割后制备的DNA则在多个位点表现出异常，由此证明是正常组织混杂造成了假阴性。有5例经显微切割提取的肿瘤DNA及相应尿沉渣中都没检测到微卫星异常，可能为我们选择的位点所限。还有1例（病例9）的尿沉渣有多个位点的异常，而在其相应的肿瘤组织中却均为阴性，这可能是由于尿沉渣与所检查的手术标本的肿瘤细胞克隆来源不同所致（见表1、2）。在我们的结果中许多病例的肿瘤与尿沉渣的微卫星改变模式不同，这与国外的报道一致[5]，反映出肿瘤发生发展过程中的克隆异质性是一个普遍现象。
另一个非常值得注意的现象是，我们建立的诊断位点组合与美国人报道的明显不同。例如D9S171是美国人中多态性和阳性率都很高的一个位点[5]，但在中国人群中的杂合度却很低,在我们所研究的38个个体中只有两例是杂合子；美国人报道的另一个很有意义的位点D9S747在中国人群中虽有较高的多态性，但发生异常改变的病例却很少（资料未显示），因而两者均不适用于中国人膀胱癌的诊断。这些现象反映出中国人和美国人之间的人种差异，以及可能存在的膀胱癌的病因学差异。当然，我们的诊断位点组合与美国人报道的也存在相同之处，例如位点D9S162、D17S695、D16S476等，这反映出两组人群在膀胱癌的发生演进中的共同点。
肿瘤的发生、发展是一个多阶段、涉及多种遗传学改变的复杂过程。由于不同人种间的遗传背景以及可能的病因和分子病理机制方面的差异，同一肿瘤在不同人群中的遗传学改变可能不尽相同。在我们的结果中这种差别显而易见；可以想像，这个概念对于微卫星以外的其它遗传学标记也应普遍适用。因此，在选择遗传学标记进行研究时，一定要考虑到这种差异：发生于某一人种群中的遗传学改变的模式不一定能够在其他人种群之中完全再现。
致谢：感谢美国国立卫生研究所的HuNan博士、美国德克萨斯大学MD安德森医学中心的MaoLi博士和约翰霍布金斯大学的JenJin博士在微卫星分析及显微切割技术方面给予的帮助。
基金项目：本课题受国家“九五”攻关项目(96－906－01－14)资助
[参考文献]
1，周荣祥.膀胱肿瘤流行病学[A].见：周荣祥主编.膀胱外科[M].第一版.北京：人民卫生出版社，1994：145～147.
2，周荣祥.膀胱肿瘤临床表现及诊断[A].见：周荣祥主编.膀胱外科[M].第一版.北京：人民卫生出版社，1994：171～182.
3，Nawroz H, Koch W, Anker P, et al. Microsatellite alterations in serum DNA of head and neck cancer patients [J]. Nat Med, 1996, 2: 1035～ 1037.
4，Sanchez Cespedes M, Monzo M, Rosell R, et al. Detection of chromsome 3p alterations in serum DNA of non small cell lung cancer patients [J]. Ann Oncol, 1998, 9: 113～ 116.
5，Mao L, Schoenberg MP, Scicchitano M, et al. Molecular detection of primary bladder cancer by microsatellite analysis [J]. Science, 1996, 271: 659～ 662.
6，Jen J, Kim H, Piantadosi S, et al. Allelic loss of chromosome 18q and prognosis in colorectal cancer [J]. New Eng J Med, 1994, 331: 213～ 221.
收稿日期：2000－04－12;修回日期:2000－05－08
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