抗APO-1单抗诱导人膀胱癌多药耐药细胞凋亡的研究

中国肿瘤生物治疗杂志 2000年第1期第7卷 论著

作者：王祥卫　杨唐俊　何斌　金欢胜　曾毅　刘素英

单位：王祥卫　杨唐俊　何斌　金欢胜　曾毅　刘素英（第三军医大学附属新桥医院泌尿外科　重庆　400037）

关键词：抗APO-1单抗；多药耐药；细胞凋亡

　　摘　要　目的： 探讨人膀胱癌多药耐药细胞凋亡诱导途径。方法： 应用免疫细胞化学、原位DNA末端转移酶标记法、相差显微镜及电镜技术，观察BIU-87/ADM细胞表面Fas抗原的表达和抗APO-1单抗对该细胞存活的影响及其特征。结果： Fas抗原在BIU-87/ADM中有高表达，经抗APO-1单抗作用后，BIU-87/ADM细胞存活率明显降低，光镜及电镜下观察到凋亡细胞的形态学改变，原位DNA末端转移酶标记阳性。结论： 抗APO-1单抗能与肿瘤细胞表面的Fas抗原结合，触发人膀胱癌多药耐药细胞凋亡。

　　《中国图书资料分类法》分类号　 R73-361

Apoptosis of Human Bladder Cancer BIU-87/ADM Cells Induced by Anti-APO-1 Antibody

Wang Xiangwei, Yang Tangjun, He Bin, Jin Huansheng, Zeng Yi, Liu Suying

　　(Department of Urology, Xinqiao Hospital, The Third Military Medical University, Chongqing 400037)

　　Abstract　Objective： To explore the methods of inducing apoptosis in human bladder cancer multidrug resistance cells. Methods： Expression of Fas antigen was detected with immunocytochemistry on BIU-87/ADM cells, and the effect of anti-APO-1 antibody was examined with in situ DNA terminal deoxynucleotydyl transferase assay (TDT)，phase-contrast and electron microscope techniques. Results： We found that Fas antigen was highly expressed on BIU-87/ADM cell surface, and after treatment with anti-APO-1 antibody, survival rate of BIU-87/ADM cells was decreased, apoptotic morphological changes and TDT positive cells were found. Conclusion： These results suggested that anti-APO-1 antibody could induce apoptosis of BIU-87/ADM cells by combining Fas antigen.

　　Key words　anti-APO-1 antibody； multidrug resistance; apoptosis

　　肿瘤细胞的多药耐药(multidrug resistance, MDR)是临床肿瘤化疗的严重障碍，深入研究其发生机制及其逆转途径具有重要的意义。我们曾应用阿霉素（adriamycin, ADM）诱导人膀胱癌敏感细胞株BIU-87，成功地建立了耐药细胞株BIU-87/ADM^［1］，并进行了逆转的实验研究^［2］。目前，有关Fas抗原在膀胱癌多药耐药细胞中的表达及抗APO-1对MDR的逆转研究未见报道。本文应用免疫细胞化学技术(immunocytochemistry assay)及原位DNA末端转移酶标记法（in situ DNA terminal deoxynucleotydyl transferase assay），对耐药细胞株BIU-87/ADM中Fas抗原表达及抗APO-1单抗的作用进行研究，结果报告如下：

　　1　材料与方法

　　1.1　细胞株及细胞培养

　　人膀胱癌BIU-87细胞株引自北京医科大学泌尿外科研究所。耐药细胞株BIU-87/ADM，由我科应用阿霉素大剂量冲击结合低浓度诱导敏感细胞株BIU-87所建立(1994年)。细胞置于含5%CO₂,37℃饱和湿度的孵箱中培养，每3天换培养液1次；细胞融合时，用0.25%胰蛋白酶消化、传代。

　　1.2　试剂

　　MTT（噻唑蓝）Sigma出品。鼠源性抗人APO-1单抗(IgG₃)， 由Prof. P.H.Krammer(German Cancer Reserch Center, Germany)惠赠。原位DNA末端转移酶标记试剂盒，购自德国宝灵曼公司。

　　1.3　研究方法

　　1.3.1　细胞生存率测定

　　采用MTT法。应用DG-3022A酶联仪测定样品吸光度(A)值（570 nm），计算细胞存活率。

　　1.3.2　细胞形态学改变

　　按1×10⁶/ml 细胞密度接种BIU-87/ADM细胞于玻片上，24 h后按试验分组分别加入不同浓度的抗APO-1单抗（10 ng/ml, 100 ng/ml,1 000 ng/ml）继续培养24 h, 36 h后（对照组加入无药培养液）；于光镜及透射电镜下，观察凋亡细胞的形态学改变。

　　1.3.3　DNA断裂的检测

　　应用原位DNA末端转移酶标记法^［3］。按1×10⁶/ml 细胞密度接种BIU-87/ADM细胞于玻片上，24 h后按试验分组分别加入不同浓度的抗APO-1单抗（10 ng/ml，100 ng/ml，1 000 ng/ml）继续培养48 h（对照组加入无药培养液）。按文献［3］介绍的方法进行。阳性细胞为胞核呈棕黄色，不着色为阴性。同时应用PBS代替DNA末端转移酶，作为阴性对照。细胞凋亡指数（apoptotic Index , AI）：每张玻片选取5个视野（×400），计数500个细胞，求得阳性百分率。

　　1.3.4　免疫荧光细胞化学染色检测BIU-87/ADM 及BIU-87细胞表面Fas抗原表达

　　①间接法。②荧光显微镜下观察、摄像。③发黄绿色荧光为阳性。

　　1.4　统计方法

　　所有数据，以均数±标准差表示；用t检验进行2个样本率的比较。

　　2　结　果

　　2.1　细胞存活率

　　应用MTT法，测定相同时间内（72 h）不同浓度的抗APO-1单抗对BIU-87/ADM细胞存活率的影响。如图1所示，随抗APO-1单抗浓度的增加，BIU-87/ADM细胞存活率明显下降（P＜0.01）。

图1　抗APO-1单抗对BIU-87/ADM细胞生存率的影响

　　Fig.1　The effects of anti-APO-1 antibody on the BIU-87/

　　ADM cell survival rate

　　2.2　凋亡细胞的形态学改变

　　相差显微镜下观察发现，BIU-87/ADM细胞在100 ng/ml抗APO-1单抗作用24 h后，细胞体积缩小、胞浆固缩、胞核变小，胞膜完整。电镜显示，细胞表面微绒毛消失、细胞核沿核膜内侧边缘固缩，部分细胞核膜消失，核染色质聚集。随作用时间的延长（36 h）及剂量的增加（1 000 ng/ml），上述改变明显加重，并出现核碎裂、胞膜完整性的破坏

　　2.3　细胞凋亡指数（AI）

　　图2显示不同浓度的抗APO-1单抗作用 BIU-87/ADM细胞48 h后，所诱导的细胞凋亡指数随抗APO-1单抗浓度的增加而增高（各浓度间比较，P＜0.05）。

图2　抗APO-1单抗诱导的BIU-87/ADM细胞凋亡指数

　　Fig.2　Apoptotic index of BIU-87/ADM cells induced

　　by anti-APO-1 antibody

　　2.4　Fas抗原的表达

　　采用免疫荧光染色法检测Fas抗原在BIU-87/ADM及BIU-87细胞中的表达。荧光显微镜下发现，BIU-87/ADM及BIU-87细胞胞膜发出明亮的黄绿色荧光，呈带状分布（图3，4）。Fas抗原在BIU-87/ADM及BIU-87细胞中的表达无明显差异。

图3　Fas抗原在BIU-87/ADM细胞中的表达(×400)

　　Fig.3 Expression of Fas antigen on human bladder

　　cancer BIU-87/ADM cell surface (×400)

图4　Fas抗原在BIU-87细胞中的表达(×400)

Fig. 4 Expression of Fas antigen on human bladder

　　cancer BIU-87 cell surface (×400)

　　3　讨　论

　　近年来，有关肿瘤细胞多药耐药发生机制及其逆转研究较多，所采用的逆转途径多依据以下机理：①mdr1基因表达增强；②拓扑异构酶Ⅱ（TopoⅡ）含量及活性下降；③细胞内谷胱甘肽硫转移酶增多，细胞解毒功能增强等^［4］。鉴于这些机理大多只能解释部分肿瘤细胞多药耐药现象，而且大多数逆转剂毒、副作用大，限制了其临床应用。本文则试图应用抗APO-1单抗诱导膀胱癌多药耐药细胞凋亡。

　　随着细胞凋亡研究的深入，人们发现许多化疗药物是通过诱导肿瘤细胞凋亡来发挥抗癌效应的。细胞凋亡是一种主动的细胞死亡形式，主要表现为形态学变化及DNA的断裂。检测细胞凋亡生化改变所致的DNA断裂方法主要有DNA凝胶电泳、流式细胞仪及原位DNA末端转移酶标记法等^［5］。我们应用光镜、电镜及原位DNA末端转移酶标记法证实, 抗APO-1单抗能诱导人膀胱癌BIU-87/ADM细胞凋亡。我们同时发现Fas抗原在BIU-87/ADM细胞中表达水平较高。BIU-87细胞表面亦有Fas抗原的表达，与BIU-87/ADM细胞相比，无明显差异；而bcl-2及mdr1基因在BIU-87/ADM细胞中有高表达^［6］。

　　目前，已证实Fas抗原是细胞膜表面的一种糖蛋白，又称APO-1抗原，属于TNF受体超家族，分子量为50 kD。APO-1抗原在激活的正常人淋巴细胞膜表面、恶性肿瘤细胞膜上都具有较强的表达。抗APO-1抗体与恶性淋巴瘤细胞表面APO-1抗原结合，即可触发和诱导细胞凋亡^［7］。日本学者Itoh等首次克隆了人的APO-1 cDNA序列，由2 534 bp组成。重组表达人APO-1抗原分子的转导细胞，对抗APO-1抗体非常敏感，而且呈剂量依赖性。APO-1基因的转导及表达，可使宿主细胞受APO-1系统诱导而发生凋亡的易感性增加。因此，APO-1基因，称为“自杀基因”^［8］。但是，并非所有的Fas抗体都能诱导靶细胞的凋亡。APO-1/Fas很可能具有接受生长和凋亡双重信号的功能，其最终效应取决于Fas的分子表位和细胞背景。Lynch报道CH-11（一种Fas抗体）能介导MP-1细胞株的凋亡，另一种Fas抗体M38则能抑制CH-11所介导的凋亡过程，但M38并不能阻断CH-11与MP-1细胞的结合^［9］。说明M38通过结合在靶细胞表面Fas的不同于CH-11的另一分子表位，阻断原来的信号传递系统或激发另一信号传递系统而发挥其抑制凋亡的作用。从分泌抗APO-1抗体的杂交瘤细胞系中分离、纯化得到IgG₃，IgG₁，IgG_2b，IgG_2a和IgG_a抗体。这些类型的抗APO-1抗体诱导细胞凋亡的能力截然不同，依次为IgG₃，IgG₁，IgG_2a，IgG_a和IgG_2b。抗APO-1抗体诱导细胞凋亡的能力取决于与APO-1抗原分子的结合及交联作用^［10］。我们应用IgG₃型抗APO-1单抗作用于BIU-87/ADM细胞，结果表明，抗APO-1单抗能够诱导BIU-87/ADM细胞凋亡，且具有明显的剂量效应。本研究结果与文献中报道的抗APO-1单抗对恶性淋巴瘤细胞的凋亡作用一致^［7］ 。应用APO-1单抗可诱导表达Fas抗原的人膀胱癌多药耐药细胞凋亡。设想通过构建Fas抗原表达载体，转染Fas抗原低表达或无表达的肿瘤细胞，促使肿瘤细胞表面Fas抗原高表达，应用APO-1单抗均可诱导表达Fas抗原的肿瘤细胞凋亡。

　　参 考 文 献

　　1，杨唐俊， 范立新， 杨清浩. 人膀胱癌BIU-87细胞系多重抗药性的形成. 中华泌尿外科杂志， 1996, 17(9): 527

　　2，杨清浩， 杨唐俊， 范立新. 人膀胱癌多重抗药性逆转的实验研究. 中华泌尿外科杂志， 1997, 18(5): 278

　　3，Gavrieli Y, Sherman Y, Ben-Sasson SA, et al. Inditification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation. J Cell Biol, 1992， 119: 493

　　4，Mosco JA, Cowan KH. Multidrug resistance. J Natl Cancer Inst, 1988, 80: 14

　　5，Arends MJ, Morris RG, Smith AL, et al. Apoptosis: The role of the endonuclease. Am J Pathol , 1990, 136: 593

　　6，王祥卫， 杨唐俊， 何 斌, 等. bcl-2基因表达在人膀胱癌多药耐药现象中的意义. 中华泌尿外科杂志， 1999, 20(4): 234

　　7，Suda T, Takahashi T, Golstein P, et al. Molecular cloning and expression of Fas ligand, a novel membrane of the tumor necrosis factor family. Cell, 1993, 75: 1169

　　8，Itoh N, Yonehara S, Ishii A, et al. The polypeptide encoded by the cDNA for human cell surface antigen Fas can mediated apoptosis. Cell, 1991, 66: 233

　　9，Lynch DH, Ramsdell F, Alderson MR. Fas and FasL in the homeostatic regulation of immune responses. Immunol Today， 1995， 16(12): 569

　　10，Dhein J, Daniel P, Trauth B, et al. Induction of apoptosis by monoclonal antibody anti-APO-1 class switch variants is dependent on cross-linking of APO-1 cell surface antigens. J Immunol, 1992, 149: 3166

(1999-01-25收稿； 1999-06-28修回)