N-甲基亚硝基脲诱发大白鼠膀胱肿瘤病理学动态观察

山西医药杂志 2000年第1期第29卷 实验研究

作者：刘红耀　张旭　刘春　王东文　米振国　佟锦　李春华　李柄太　范健

单位：刘红耀（山西医科大学第一医院(030001)）；张旭（山西医科大学第一医院(030001)）；刘春（山西医科大学第一医院(030001)）；王东文（山西医科大学第一医院(030001)）；米振国（山西医科大学第一医院(030001)）；佟锦（山西医科大学第一医院(030001)）；李春华（山西医科大学）；李柄太（山西医科大学）；范健（山西医科大学）

关键词：化学致癌剂；N-甲基亚硝基脲；动物模型；膀胱肿瘤

　　摘　要：目的　研究N-甲基亚硝基脲(MNU)诱发大白鼠膀胱肿瘤的发生、发 展过程。方法　以MNU为诱癌剂，进行大白鼠膀胱灌注，对其诱发的膀胱肿 瘤过程的不同时期进行动态观察。结果　第1次MNU灌注后第2周8/10只出现 单纯增生，第6周9/10只表现为乳头状肿瘤，第8周10/10只出现膀胱癌，主要为表浅膀胱癌 ，第10周6/10只为浸润癌。结论　MNU诱发的肿瘤发生、发展经历了从单纯 增生→乳头状、结节状良性增生→乳头状肿瘤→非浸润癌→浸润癌这样一个典型病理

　　过程。

MNU-induced bladder tumor and its pathologically dynamic obser vations in rats

Liu Hongyao,Zhang Xu,Liu Chun,et al

　　（The First H ospital of Shanxi Medical University,Taiyuan，030001,China）

　　Abstract：Objective　To study the pathologically dynamic a lterations in experimental animal model of bladder tumors induced by MNU.M ethods Bladder tumors were induced in female Wistar rats by intravesical irrigation of the carcinogen,N-methyl-nitrosourea (MNU).The morphological alte rations of bladder epithelial cells were studied by light microscopy on weeks 2, 4,6,8 and 10 after the MNU irrigation.Results Since the MNU irrigat ion 8 of the ten rats had simple hyperplasia on the second week;9 of them had be nign papilloma on the sixth week;all of them had carcinoma on the eighth week;an d 6 of them suffered from invasive carcinoma on the tenth week.Conclusion The study showed there runs a typical pathologic process induced by MNU as follows：simple hyperplasia,papillary or nodular hyperplasia,benign papilloma ,noninvasive carcinoma and invasive carcinoma.The histopathological features of animal are basically similar to those of the human.

　　Key words：Carcinogen;　N-methyl-nitrosourea;　Experimen tal animal model；　Bladder tumor

　　膀胱肿瘤是泌尿外科最常见的肿瘤，其防治研究需要建立合适 的肿瘤模型，N-甲基亚硝基脲(MNU)为直接致癌剂，自Hicks首次用来诱导膀胱肿瘤以来， 国外对此研究较多，国内研究较少，本实验就MNU诱发的大白鼠膀胱肿瘤的发生、发展过程 进行了动态观察，现报告如下。

　　1　材料与方法

　　1.1　试剂

　　致癌剂N-甲基亚硝基脲(MNU)，由美国Sigma公司生产，冷藏于－20 ℃冰箱中。

　　1.2　实验动物及分组

　　选用Wistar雌性大白鼠，6～7周龄，共60只，体重(160±16) g。将其随机分为两组。A组( 诱癌组)50只MNU膀胱灌注每次2 mg/只，每2周1次，共4次，MNU总量8 mg；B组(对照组)10只 不做特殊处理。

　　1.3　实验方法

　　1.3.1　MNU溶液的配制：在实验前一天将MNU置于4 ℃冰箱中过夜，以pH=6.0的枸橼酸缓 冲液为溶剂，配成浓度为20 g/L。

　　1.3.2　MNU膀胱灌注法：用0.6%的戊巴比妥钠腹 腔注射麻醉(30 mg/kg)，麻妥后用1‰ 的新洁尔灭消毒尿道外口，用消毒后的硬膜外导管导尿后，膀胱灌注。

　　1.3.3　标本采集：于第1次灌注MNU后第2、4、6、8、10周各取诱癌组10只大白鼠，对照 组2只大白鼠将其处死后，立即导尿(尿液做大体肉眼及镜下观察)后注入生理盐水约2 mL， 使膀胱处于扩张状态，剖腹显露膀胱，将其完整切除，纵行切开，观察其大体变化，在病变 明显处多处取材，送光镜观察。

　　1.3.4　光镜标本制备：将新鲜组织块于10%甲醛中固定24 h，常规石蜡包埋、切片4～5 μm，HE染色。

　　2　结　　果

　　2.1　一般观察

　　所有灌注MNU的大白鼠，于麻醉后2～2.5 h排尿，4～6 h恢复活动，约12 h后恢复正常。仅 A组1只导尿后，尿道外口溢血，3 d后消失。所有动物处死前，体重、活动无明显差异。

　　2.2　病理观察

　　2.2.1　肉眼大体观察：B组所有大白鼠膀胱壁粘膜光滑，新鲜标本为粉红色、有光泽，甲 醛固定后为白色，膀胱内无溃疡，充血、憩室及赘生物。A组50只大白鼠膀胱壁粘膜均发生 变化，且随MNU作用时间的延长、量的增多，其变化越来越明显：第2～4周膀胱内可见有点 状、片状出血，局部粘膜隆起；第6～8周膀胱壁增厚，其表面可见多发的米粒状小乳头状肿 物。第10周膀胱均见肿物，有的为占据整个膀胱腔，呈菜花状，乳头短，呈红色，局部为竭 色，有的表面溃疡，肿物活动差。

　　2.2.2　光镜结果：B组所有大白鼠膀胱粘膜上皮由2～3层移行上皮细胞组成，细胞扁平大 小一致，排列有序，核圆形、浅染，粘膜细胞核浆比例1∶4～6。由内向外依次为粘膜层、 固有层、肌层和浆肌层。A组大白鼠膀胱壁粘膜均渐进性发生不同程度变化，表现为：第2周 膀胱粘膜层增厚5～7层，基底细胞活跃，可达2～3层，但全层极向分明，无异形性，细胞大 小、核浆比例基本正常。第4周镜下为膀胱粘膜增厚，乳头为圆锥形，乳头项窄底宽，细胞 排列一致，极向分明，细胞无异形性。第6周可见乳头状瘤，乳头表面被覆上皮细胞与正常 粘膜上皮结构基本相同3～5层，分化正常，排列整齐，乳头质纤细，由少量结缔组织构成， 含较多薄壁毛细血管。第8周发生癌变，表现为乳头彼此粘连，细胞数目5层以上，核排列紧 密大小不一，间质纤细，由少量结缔组织构成，核染色呈粗颗粒状堆积核膜下。第10周异形 明显，表现为细胞大小不一，排列紊乱，极向消失，核大，形态不一，核畸形，核染色质呈 粗粒状，分布不均匀，常堆积于核膜下，核膜增厚，核仁肥大，核浆比例大，可见核分裂象 ，有的表现为癌细胞高度未分化，移行上皮结构特征完全消失，呈弥漫分布或排列成实体性 癌巢，癌细胞多形性明显，大小悬殊。癌细胞侵犯粘膜固有层及肌层。除A组3只大白鼠输尿 管下端局部增厚，病理为增生，及1只大白鼠左肾积水，病理变化为肾萎缩，其余各组其他 脏器未见异常，淋巴结未见转移灶。

　　3　讨　　论

　　早在1938年文献［1］等用己萘胺喂狗诱发了膀胱肿瘤。文献［2，3］1964年报道了在饮水 中加用N-丁基-N-(4-羟丁基)亚硝胺(BBN)40周诱发了膀胱肿瘤，1967年Erturk^{［1 ］}报道了N-［4-(5-硝基-2-呋喃基)-2-噻唑基］甲酰胺(FANFT)诱发膀胱肿瘤，但 上述方法均需经口给予，因饮水瓶常有漏水现象，用量不易确切，不利于对照和统计处理， 且有需时长(20周)、费用昂贵等缺点，Hicks^［4］首次报道了MNU经膀胱灌注诱发了 膀胱肿瘤实验模型，与BBN、FANFT相比较，MNU诱发肿瘤方法简单，用量少，诱瘤需时短。

　　3.1　MNU诱发大白鼠膀胱肿瘤的病理过程

　　MNU分子式CH₃N(NO)CONH₂，属亚硝基化合物中的亚硝酰胺类，为直接致癌剂，多数学者 认为与细胞内某些结构的烷基化有关，它能使细胞大分子，特别是核酸的鸟嘌呤分子发生烷 化作用(甲基化作用)。MNU自发分解与溶液pH值有关^［5］，pH=6时其半衰期为300 min，pH=7时72 min，pH=8时为6 min。本实验采用pH=6枸橼酸缓冲液为溶剂，30 min内用完。 其半衰期较Hicks^［4］采用的pH=7的缓冲液相对长，确保MNU在膀胱内的作用时间， 增强了MNU的诱癌作用，本实验采用戊巴比妥钠麻醉，经尿道用硬膜外导管导尿后灌入MNU， 95%的大白鼠于麻醉后2～2.5 h方排尿，满足MNU在膀胱内保留2 h，排除了Serers等^{［ 5］}及Hicks^［4］灌入后钳夹尿道2 h可能造成的损伤。本实验采用多次灌注法，符 合Rous和Kidd提出的恶性肿瘤发生的两个阶段即启动阶段及促癌阶段理论，而这一理论对临 床及预防医学中防癌、治癌有指导意义。本实验采用MNU多次膀胱灌注法，大白鼠膀胱壁粘 膜渐进性发生不同程度变化，其肿瘤发生、发展与人类肿瘤相似经历了从单纯增生→乳头状 、结节状良性增生→乳头状肿瘤→非浸润癌→浸润癌这样一个典型病理过程。在给药6～8周 的标本中可见上述各种不同阶段的病理变化同时存在，提示大白鼠膀胱肿瘤在时间与空间上 具有多病灶的特点。Irving等^［6］研究表明，MNU分次灌入膀胱内其诱癌率与MNU总 量或灌入次数正相关，且诱癌需时与MNU总剂量负相关。Serers等^［5］报道了少量多 次MNU灌入膀胱其肿瘤发生率较大量少次的显著增高。

　　3.2　MNU诱癌的特异性及人膀胱肿瘤性质比较

　　本实验诱癌组结果表明，除膀胱外其他脏器未见肿瘤发生，仅3只输尿管下端局部增厚(1只 管腔狭窄致肾积水)病理检查均为增生，考虑与反流有关，与国外Hicks及Serers一致，证明 MNU膀胱灌注具有膀胱特异性。本实验诱导的膀胱肿瘤组织学形态及病理特征与人膀胱肿瘤 十分相似，都来自粘膜上皮，其中移行上皮癌占80%，较人类膀胱肿瘤中移行上皮癌(90%)低 ，与国外观察相同，20%为鳞癌及鳞癌与移行细胞混合，较人类较高(6%～7%)，考虑与MNU局 部刺激使细胞鳞状化生有关，但观察膀胱癌全切除标本发现膀胱癌中50%为混合性肿瘤。其 中移行上皮和鳞状细胞混合肿瘤为36%。本实验诱癌组未见腺瘤，人类膀胱癌中腺癌最少， 仅约占1%～2%。

　　总之，MNU诱发的大白鼠膀胱肿瘤病理过程可分为3个阶段，即：上皮增生期(2～3周)、乳头 状瘤形成期(6～8周)和癌变期(8～10周)。

　　基金项目：青年基金课题(991024)

　　作者简介：刘红耀，男，1965年5月生，主 治医师，山西医科大学第一医院，030001

　　参考文献：

　　［1］　Erturk E,Price JH,Cohen S,et al.The production of carcinomas o f the urinary bladder in rats by feeding N-(4-5-nitro-2-furyl)-2-thiazoly formamide.Cancer Res,1967,27:1988-1998

　　［2］　Ito N,Hiasa Y,Tamai A,et al.Histogensis of urinary bladder tum ors induced by N-butyl-N(4-hydroxybutyl)nitrosamine in rats.GANN,1969,60:401 -410

　　［3］　Druckrey H.Selekture Enzengung von Blasenkrebs an Ratten durch Dibutyl and N-Butyl-N-butanol (4)-nitrosamin.Z Krebsforsch,1964,66:280

　　［4］　Hicks RM.Multistage carcinogenesis in the urinary bladder.Br M ed Bull,1980,36:39-46

　　［5］　Serers NJ,Barnes SH,Wright R,et al.Induction of bladder cancer in rats by fractionated intravesicular doses of N-methyl-N-nitrosourea.Br J Cancer,1982,45:337-350

　　［6］　Irving CC,Cox R,Murphy WM,et al.Influence of dose of N-nitros ourea on the induction of urinary bladder cancer in rats.Cancer letter,1979,8(1):3-7

收稿日期：1999-11-02