乳腺癌和癌前病变中细胞凋亡及其与bcl-2、PCNA表达的关系
临床与实验病理学杂志 1999年第2期第15卷 论著
作者：闵大六 王保太 孟刚 杨枫
单位：闵大六 王保太 孟刚 杨枫（安徽医科大学病理学教研室，合肥 230032）
关键词：乳腺肿瘤；凋亡；癌前状态；细胞增殖；基因；bcl-2；增殖细胞核抗原
摘要 目的：探讨细胞凋亡在乳腺癌变过程中的作用及其与细胞增殖以及bcl-2、PCNA表达的关系。方法：利用TUNEL法及免疫组化S-P法检测54例乳腺癌及27例非癌病变中细胞凋亡指数（AI）以及bcl-2、PCNA的表达；同时计算核分裂指数（MI）。结果：“正常”乳腺上皮、增生性导管、原位癌及浸润性癌的AI和MI分别为：0.10％±0.12％、0.31％±0.43％、0.41％±0.21％、0.74％±0.56％和0.02％±0.05％、0.01％±0.16％、0.22％±0.17％、0.57％±0.35％（P＜0.05）；AI与MI呈正相关（r=0.87，P＜0.01），且随着病变的发展，AI/MI呈下降的趋势。“正常”乳腺上皮、增生性导管、原位癌、浸润性癌中bcl-2、PCNA表达率分别为：68.42％、62.50％、55.56％、48.89％和26.32％、37.50％、66.67％、88.89％；PCNA表达与MI呈正相关（rs=1, P＜0.01）。癌组织中，bcl-2高表达者AI显著低于bcl-2低表达者。结论：细胞凋亡和细胞增殖均参与乳腺癌变的过程，bcl-2在乳腺癌中具有抑凋亡作用，且bcl-2表达缺失在乳腺癌变中是一个相当晚的事件。
中国图书分类号 R737.9；R392.31 文献标识码 A 文章编号 1001-7399(1999)02-0099-04
Apoptosis and immunohistochemical bcl-2、PCNA expression in breast carcinoma and precancerous lesions
Min Daliu Wang Baotai Meng Gang et al
(Dept of Pathol, Anhui Medical University, Hefei 230032)
ABSTRACT Purpose To explore the role of apoptosis in breast carcinogenesis and the relationship between apoptosis and cell proliferation and bcl-2、PCNA expression.Methods The methods of TUNEL and immunohistochemical S-P were used to investigate the occurence of apoptosis and bcl-2、PCNA expression in 81 female breast carcinomas and 27 cases noncancer lesions. Apoptosis index(AI) and mitotic index (MI) were calculated in all of the tissues.Results AI and MI in normal breast epithelial tissues, hyperplastic ductal tissues, carcinomas in situ and invasive ductal carcinoma tissues were 0.10％±0.12％、0.31％±0.43％、0.41％±0.21％、0.74％±0.56％ and 0.02％±0.05％、0.01％±0.16％、0.22％±0.17％、0.57％±0.35％ respectively （P＜0.05）. There was a significant direct correlation between them （r=0.87，P＜0.01）. The incidences of bcl-2 and PCNA positivity in normal breast epithelial tissues, hyperplastic ductal tissues, carcinomas in situ and invasive carcinoma tissues were 68.42％、62.50％、55.56％、48.89％ and 26.32％、37.50％、66.67％、88.89％ respectively. Breast carcinomas expressing bcl-2 were significantly more likely to have low AI.Conclusion Both apoptosis and cell proliferation take part in breast carcinogenesis. Bcl-2 is responsible for inhibition of apoptosis in breast carcinomas, and the loss of bcl-2 expression is a relatively late event in the progression of breast carcinoma.
KEY WORDS breast neoplasms; apoptosis; precancerous condition; cell proliferation; bcl-2 oncogene; proliferation cell nuclear antigen
近年来，随着对细胞凋亡的深入研究，人们逐渐认识到肿瘤的发生不仅与细胞异常增殖有关，而且与凋亡有关。无论良性肿瘤还是恶性肿瘤，其生长都是由于细胞增殖与细胞丢失间的失衡所致〔1〕。细胞丢失最重要的机制之一就是细胞凋亡。我们通过检测乳腺癌及癌前病变中细胞凋亡发生率、细胞增殖水平及bcl-2、PCNA表达情况，探讨细胞凋亡在乳腺癌组织发生中的意义及其与凋亡调控基因和细胞增殖的关系。
1 材料和方法
1.1 材料 收集1997年1月～10月安徽医科大学一附院乳腺癌手术切除标本。其中癌旁“正常”乳腺组织（距癌组织4 cm）19例，增生性乳腺组织（含普通型及不典型增生）8例，导管原位癌9例，浸润性导管癌45例。
患者均为女性，年龄23～81岁，平均46岁，术前均未接受过放疗或化疗。标本经10％中性福尔马林固定，石蜡包埋、4 μm连续切片。乳腺癌癌旁病变的判定及癌组织分级参照龚西马 俞〔2〕、陈忠年〔3〕提供的标准进行。
1.2 染色方法
1.2.1 TUNEL法标记凋亡细胞 原位凋亡试剂盒购自上海华美生物试剂公司。用PBS代替TdT作空白对照，结果阴性；用已知阳性凋亡细胞切片（小肠粘膜）作阳性对照，结果阳性，凋亡细胞染成棕黄色。TUNEL法参照Gavrieli等〔4〕方法操作。
1.2.2 免疫组化染色 采用S-P法。抗bcl-2蛋白单克隆抗体、抗PCNA蛋白单克隆抗体及S-P试剂盒均购自福州迈新生物试剂公司。用PBS代替一抗作空白对照结果阴性；用已知阳性的扁桃体及淋巴瘤组织切片作阳性对照，结果阳性，胞核或胞浆染成棕黄色。
1.3 结果判断
1.3.1 核分裂指数（mitotic index, MI）和凋亡细胞指数（apoptosis index, AI）的计算 用曝光的彩色底片自制成10×10测试网格置于目镜上，在高倍视野（×400）下，分别随机计数HE及TUNEL染色切片中不重复视野中1 000个细胞的核分裂象及凋亡细胞数，分别计算百分率即为MI和AI。
1.3.2 免疫组化染色结果判定标准 见表1。
表1 免疫组化染色结果评分标准
| 阳性细胞 |
|
染色强度 |
评定结果* |
| 百分比（％） |
计分 |
强度 |
计分 |
|
0 |
0 |
0 |
0 |
-（0分） |
| 1～ |
1 |
淡黄 |
1 |
+(2～3分) |
| 26～ |
2 |
棕黄 |
2 |
 （4～5分） |
| 51～ |
3 |
棕褐 |
3 |
 （6～7分） |
| 76～ |
4 |
由阳性细胞和染色强度计分相加
1.4 统计方法 阳性率间比较用χ2检验；AI和MI间比较用t检验及相关分析；阳性率（bcl-2、PCNA表达）与AI和MI间比较用等级相关分析。2 结果
2.1 凋亡细胞指数（AI）和核分裂指数（MI） TUNEL法显示乳腺癌及癌前病变中凋亡细胞或凋亡小体呈单个散在分布；周围无炎细胞浸润，与HE切片观察到的凋亡细胞呈胞浆浓缩；核深染，单个分布形态一致。不同组织的AI和MI见表2。
表2 乳腺癌及癌前病变中AI和MI比较
| 类别 |
n |
AI |
MI |
| “正常”乳腺组织 |
19 |
0.10±0.12 |
0.02±0.05 |
| 增生性导管 |
8 |
0.31±0.43** |
0.10±0.16* |
| 原位癌 |
9 |
0.41±0.21 |
0.22±0.17 |
| 浸润性导管癌 |
| Ⅰ级 |
12 |
0.59±0.56 |
0.39±0.29 |
| Ⅱ级 |
27 |
0.74±0.50 |
0.55±0.64 |
| Ⅲ级 |
6 |
1.18±0.60 |
1.03±0.28 |
| 合计 |
45 |
0.74±0.56 |
0.57±0.35 |
与“正常”乳腺组织相比*P＜0.05，**P＜0.01 经相关回归分析，AI和MI呈高度正相关（r=0.87， P＜0.01）。从“正常”乳腺组织→增生性导管→原位癌→浸润性导管癌，AI/MI比值显著下降（P＜0.05）。
2.2 bcl-2、PCNA表达结果（表3） bcl-2阳性表达主要位于细胞浆或核膜上，胞核中偶有表达。PCNA阳性表达主要位于细胞核，胞浆可见弱阳性。
表3 乳腺癌及癌前病变bcl-2、PCNA阳性率比较
| 类别 |
n |
bcl-2 |
|
PCNA |
| - |
＋ |
|
|
％ |
- |
＋ |
|
|
％ |
| “正常”乳腺组织 |
19 |
6 |
9 |
4 |
0 |
68.42 |
14 |
5 |
0 |
0 |
26.32 |
| 增生性导管 |
8 |
3 |
4 |
1 |
0 |
62.50 |
5 |
2 |
1 |
0 |
37.50 |
| 原位癌 |
9 |
4 |
4 |
1 |
0 |
55.56 |
3 |
4 |
2 |
0 |
66.67 |
| 浸润性导管癌 |
| Ⅰ级 |
12 |
4 |
6 |
1 |
1 |
66.67 |
2 |
2 |
6 |
2 |
83.33 |
| Ⅱ级 |
27 |
15 |
8 |
3 |
3 |
44.44 |
3 |
16 |
5 |
3 |
88.89 |
| Ⅲ级 |
6 |
4 |
1 |
1 |
0 |
33.33 |
0 |
2 |
2 |
2 |
100 |
| 合 计 |
45 |
23 |
15 |
5 |
2 |
48.89 |
5 |
20 |
13 |
7 |
88.89* |
*“正常”乳腺组织、增生性导管相比，P＜0.012.3 bcl-2阳性表达与AI的关系 经等级相关分析，rs=-0.829， P＞0.05，统计学上无显著性意义。但是bcl-2高表达的癌组织其凋亡发生率显著低于bcl-2低表达的癌组织凋亡发生率（P＜0.05）（表4）。
2.4 PCNA表达与MI关系 经等级相关分析，rs=1， P＜0.01。PCNA表达与MI间统计学上呈显著正相关。
表4 bcl-2阳性表达与浸润性导管癌AI关系
| 类 别 |
n |
AI（％） |
| bcl-2高表达（、） |
7 |
0.64±0.53 |
| bcl-2低表达（-、+） |
38 |
0.89±0.74 |
P＜0.053 讨论
3.1 乳腺癌及癌前病变中凋亡细胞的阳性率比较及其意义 我们通过原位检测乳腺癌和非癌病变中细胞凋亡的发生情况，发现癌旁“正常”乳腺上皮细胞凋亡发生率极低，平均凋亡指数为0.10％±0.12％，与Allan等〔5〕报道的乳腺纤维囊性变和乳腺癌癌旁“正常”上皮中细胞凋亡发生率基本一致。增生性导管上皮细胞凋亡发生率明显增高，平均为0.31％±0.43％；原位癌及浸润性导管癌中细胞凋亡也显著高于“正常”乳腺上皮，AI分别为0.41%±0.21％和0.74％±0.56％（P＜0.01）。但癌组织与增生性导管间及不同分化程度癌组织间细胞凋亡发生率差异无显著性（P＞0.05）。本研究结果发现，随着癌旁“正常”乳腺上皮→增生性导管→原位癌→浸润性癌的发展，细胞凋亡呈逐渐增高的趋势。Tomei等〔6〕实验显示细胞凋亡的抑制可能直接关系到肿瘤的发生机制。Saegusa等〔7〕在子宫内膜腺癌研究中也认为，以正常子宫内膜到癌变内膜组织中凋亡发生率明显增多，而且在癌组织中随组织分级的增加而明显增高，暗示细胞凋亡倾向的改变可能与内膜腺癌的进展和失去分化特征等有关。据本研究结果，我们认为细胞凋亡参与了乳腺癌的发生和发展。
3.2 乳腺癌和癌前病变中MI的特点及其与AI的关系 MI的大小反映组织中细胞增殖水平的高低。我们的研究发现，癌旁“正常”乳腺上皮细胞核分裂象少见，MI值近乎为零；增生性导管上皮中MI显著升高；癌变组织的MI进一步增高，提示乳腺组织癌变过程中细胞增殖活性的提高。
从癌旁“正常”乳腺上皮→增生性导管→原位癌→浸润性癌，细胞凋亡发生率和细胞增殖水平均呈递增趋势，而且癌组织的AI和MI均高于癌旁“正常”乳腺上皮。相关回归分析显示，AI和MI呈显著正相关，提示细胞凋亡和细胞增殖均参与了乳腺癌的发生。本组资料还显示，从癌旁“正常”乳腺上皮→增生性导管→原位癌→浸润性癌，AI/MI呈递减的趋势。Ferguson等〔8〕认为，在正常乳腺中，上皮细胞的核分裂和细胞凋亡在正常组织的体内平衡和乳腺上皮更新中起互补作用。Allan等〔5〕也指出许多组织中增生的细胞易于凋亡，AI/MI反映了细胞丢失和细胞增殖间的平衡关系。我们推测在乳腺癌组织发生过程中，可能由于细胞凋亡与细胞增殖比例的失衡，细胞增殖优势大于细胞凋亡，从而导致乳腺癌的形成和发展。
3.3 乳腺癌及癌前病变中bcl-2癌基因表达的特点及其意义 目前认为bcl-2是抑凋亡基因，可阻断细胞的程序性死亡而不影响细胞的增殖〔9〕。现已发现bcl-2癌基因蛋白不仅在淋巴造血组织中有表达，而且它在一些上皮细胞中也有表达。
我们研究发现癌旁“正常”乳腺上皮bcl-2表达的阳性率为68.42％，增生性导管和癌组织的表达率均降低，分别为62.50％和48.87％。在浸润性癌组织中，bcl-2高表达的癌组织其AI显著低于bcl-2低表达的癌组织（P＜0.05），提示bcl-2在乳腺癌中也具有抑制细胞凋亡的作用，随着癌组织bcl-2表达率的降低，细胞凋亡发生率显著增高。由于从癌旁“正常”乳腺上皮→增生性导管→原位癌→浸润性癌，bcl-2表达率呈递减趋势，但差异并无显著性（P＞0.05）。因此我们推测bcl-2表达的缺失在乳腺癌形成过程中是一个相当晚的事件。
3.4 乳腺癌及癌前病变中PCNA表达的特点及其意义 我们研究发现癌旁“正常”乳腺上皮PCNA表达率非常低，随着病变的发展，增生性导管中表达率明显增高，至癌变后PCNA表达显著性升高（P＜0.05）。等级相关分析显示，PCNA的表达与MI呈显著正相关（rs=1，P＜0.01），提示PCNA和MI均反映乳腺组织中细胞的增殖水平。PCNA表达率的增高反映在乳腺癌变过程中，细胞增殖速率加快，DNA合成增多，与经典乳腺癌组织发生细胞动力学研究结果一致。
作者简介：闵大六，男，29岁，讲师，硕士。研究方向：乳腺肿瘤病理
王保太，男，60岁，教授，硕士生导师
参考文献
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3 陈忠年，沈铭昌，郭慕依.实用外科病理学.上海：上海医科大学出版社，1997：601
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5 Allan DJ, Howell A, Roberts SA et al. Reduction in apoptosis relative to mitosis in histologically normal epithelium accompanies fibrocystic change and carcinoma of the premenopausal human breast. J Pathol, 1992;167:25～32
6 Tomei LD, Kanter P, Wenner CE. Inhibition of radiation induced apoptosis in vitro by tumor promoters. Biochem Biophys Res Commun, 1988;155:324～331
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8 Ferguson DJP, Anderson TJ. Morphological evaluation of cell turnover in relation to the menstrual cycle in the ‘resting’ human breast. Br J Cancer, 1981;44:177～181
9 Korsmeyer SJ. Bcl-2 initiates a new category of oncogenes: regulators of cell death. Blood, 1992;80:879～886
收稿日期：1998-06-08
修回日期：1998-10-20
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