乳腺癌中凋亡与细胞增殖及Rb、bcl-2、c-myc蛋白表达的关系
临床与实验病理学杂志 1999年第2期第15卷 论著
作者：高莉 詹洲 倪灿荣 戴益民 郑唯强 龚志锦
单位：高莉 詹洲 倪灿荣 戴益民 郑唯强 龚志锦（上海第二军医大学病理学教研室 200433）
关键词：乳腺肿瘤；细胞增殖；凋亡；基因；Rb；基因；c-myc；基因；bcl-2
摘要 目的：了解人乳腺癌中凋亡与细胞增殖的关系，以及与相关基因蛋白表达的关系及其预后意义。方法：用免疫组化LSAB法检测了90例乳腺标本(包括13例良性乳腺病变和77例乳腺癌)中Rb、bcl-2和c-myc的蛋白表达；并计数了癌组织中的凋亡指数(AI，TUNEL法)和有丝分裂指数(MI)。结果：AI与MI呈显著的正相关(r=0.81，P＜0.01)；AI、MI和Rb蛋白表达与肿瘤大小和组织学分级有关，AI、MI低和bcl-2的高表达与5年生存率有关，c-myc的表达仅与组织学等级有关(P＜0.05)；Rb表达与AI、MI均有关(P＜0.01)，而bcl-2的表达仅与AI有关(P＜0.05)。结论：乳腺癌中凋亡与细胞增殖和bcl-2表达有关，提示凋亡在具有不同生长潜能的亚群的克隆性选择中发挥重要作用。Rb与凋亡的关系提示细胞凋亡与细胞周期有关。
中国图书分类号 R737.9； R392.31 文献标识码 A 文章编号 1001-7399(1999)02-0095-04
Relationship between apoptosis and cell proliferation and expression of Rb, bcl-2 and c-myc proteins in human breast cancer
Gao Li Zhan Rongzhou Ni Canrong et al
(Dept of Pathol, Second Military Medical University, Shanghai 200433)
ABSTRACT Purpose To investigate the relationship between apoptosis and cell proliferation and the expression of the related genes as well as their prognostic significance in human breast cancer.Methods Using immunohistochemical method, the expression of Rb, bcl-2 and c-myc proteins was investigated in paraffin sections of 90 breast samples comprising 13 breast benign diseases and 77 breast carcinomas. The TUNEL-positive cells were counted as apoptosis index(AI) and mitotic cells as mitotic index (MI).Results It was noted that a significant correlation existed between AI and MI (r=0.81，P＜0.01), AI,MI and Rb expression were related to the tumour size and histologic grade. The lower AI and MI values as well as less bcl-2 expression were attributed to the 5-year survival groups. c-myc expression was only related to histologic grade (P＜0.05); Rb expression was related to both AI and MI(P＜0.01), but bcl-2 expression was only related to AI (P＜0.05).Conclusion Apoptosis in breast cancer shows to be correlated to cell proliferation and bcl-2 expression, which indicates that apoptosis may play a role in the selection of clonal subpopulation with different growth potential. The relationship between Rb and apoptosis implies that apoptosis may be involved in cell cycle.
KEY WORDS breast neoplasms; apoptosis; cell proliferation; genes, Rb; genes, c-myc; genes, bcl-2
细胞凋亡是一种由基因控制的、主动的程序化细胞死亡过程。这种死亡方式可以与具有自我更新能力的组织通过有丝分裂不断产生新细胞相平衡，因而对正常组织维持自身稳定具有重要作用。它与有丝分裂相互协调，共同参与胚胎发育、细胞老化和肿瘤发生等多种重要的生命过程。近年来，随着研究的深入，人们开始注意到，在肿瘤组织中细胞凋亡与有丝分裂并不是两个截然对立的独立过程，二者之间存在一定关系。为进一步了解肿瘤组织中的细胞增殖与凋亡的关系，本文计数了乳腺癌中核分裂象及凋亡细胞的数量，并应用免疫组化方法检测了乳腺良、恶性肿瘤中与细胞增殖及凋亡相关的几种基因的表达，包括细胞增殖抑制基因Rb、细胞凋亡抑制基因bcl-2以及促进增殖和凋亡的基因c-myc，以了解它们与增殖和凋亡的关系，以及它们对判定乳腺癌的恶性程度和预后的意义。
1 材料和方法
1.1 材料 随机选取1987～1992年长海医院外科手术切除或活检的乳腺标本共90例，其中良性13例，恶性77例。病人均为女性，年龄25～76岁，平均50.22岁。术前均未接受过放疗或化疗，全部病例术后随访至1997年11月，术后存活时间最短8个月，最长10.25年(至今仍存活)，存活时间≥5年者共43例，＜5年者34例。所有标本均经过10%福尔马林固定、石蜡包埋，连续切片，厚度4 μm。
免疫组化所用Rb、bcl-2及c-myc的单抗购自法国库尔特公司，LSAB试剂盒购自Dako公司，TUNEL试剂盒购自德国宝灵曼公司。
1.2 凋亡指数(AI)与有丝分裂指数(MI)计数 应用TUNEL法检测组织中的凋亡细胞，组织切片脱蜡至水，蛋白酶K 20 mg·L-1消化37℃20 min，其余按试剂盒说明书操作，碱性磷酸酶显色，核固红衬染，阳性细胞为紫蓝色，普通光镜连续观察10个高倍视野，计数阳性细胞数(图1)，换算为平均每平方毫米的凋亡细胞数，即为AI；HE染色，根据核分裂象的特征〔1〕计数核分裂象数量(图2)，同法换算为有丝分裂指数MI。
图1 TUNEL法染色，紫蓝色为凋亡细胞。×400
图2 Ⅲ级乳腺癌中,凋亡细胞(↑与核分裂象(▲)均较常见.HE×400
1.3 免疫组化染色 用LSAB法分别检测组织中Rb、bcl-2及c-myc的表达。组织切片脱蜡至水，3%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶20 min，微波抗原修复10 min，加一抗室温过夜，其余按试剂盒说明书操作。DAB显色，苏木素衬染，阳性细胞为棕黄色。bcl-2、c-myc一抗稀释度均为1∶50，Rb为即用型抗体。实验以已知表达阳性的正常乳腺组织为阳性对照，以PBS代替一抗作阴性对照。结果判断：以细胞中出现棕黄色颗粒为阳性细胞，阳性细胞数＞5%判断为阳性切片，反之为阴性片。
1.4 统计方法 MI与AI的关系用相关分析，率的比较用卡方检验，两均数的比较用t检验，两个以上均数的比较用方差分析(F)。
2 结果
2.1 凋亡与增殖的关系 77例恶性肿瘤中AI平均7.79±2.20，MI平均8.95±2.06，相关性检验：r=0.81，P＜0.01，即AI与MI显著正相关。
2.2 AI与MI及相关基因的表达与乳腺癌的临床指标及预后的关系(表1) AI及MI和肿瘤大小、恶性等级关系密切：(1)肿瘤直径＞2 cm组AI、MI显著高于直径≤2 cm组(P＜0.01，P＜0.05)；(2)不同恶性等级的3组之间比较，P均＜0.01，随着恶性等级增高，AI、MI也增高；(3)术后存活≥5年组的AI与MI均小于死亡组(P＜0.05)。
Rb在胞核中表达(图3)，其表达与乳腺肿瘤良恶性有关。肿瘤直径＞2 cm组阳性率显著低于直径≤2 cm组(P＜0.01)。随恶性等级增高，Rb阳性率显著降低(P＜0.05)。但在判断淋巴结转移和预后方面无统计学意义。
图3 乳腺癌中Rb在胞核中表达.LSAB×200
表1 AI、MI及相关基因与乳腺癌临床指标、预后的关系
| 项 别 |
n |
AI |
MI |
Rb(+)(%) |
bcl-2(+)(%) |
c-myc(+)(%) |
| 良恶性 |
| 良性 |
13 |
— |
— |
11(84.62) |
12(92.31) |
12(92.31)▲ |
| 恶性 |
77 |
7.79±2.20 |
8.95±2.06 |
39(50.65)* |
44(57.14)* |
69(89.61)#** |
| 淋巴结转移 |
| 无 |
24 |
7.46±2.35 |
7.87±2.26 |
13(54.17) |
15(62.50) |
21(87.50) |
| 有 |
53 |
8.02±2.17 |
9.48±2.00 |
26(49.06) |
29(54.72) |
48(90.57) |
| 肿瘤直径(cm) |
| ≤2 |
26 |
5.31±2.07 |
7.14±2.03 |
19(73.08) |
16(61.54) |
22(24.62) |
| ＞2 |
51 |
9.88±3.29** |
10.02±3.15* |
20(39.22)** |
28(54.90) |
47(92.16) |
| 恶性等级 |
| Ⅰ |
20 |
5.18±2.03 |
4.73±1.79 |
13(65.00) |
15(75.00) |
16(80.00) |
| Ⅱ |
41 |
8.01±2.20* |
9.86±1.83** |
22(53.66) |
24(58.24) |
37(90.24) |
| Ⅲ |
16 |
12.65±1.93** |
15.52±1.89** |
4(25.00)*△ |
5(31.25)*△△ |
16(100.00)△ |
| 5年随访 |
| 存活 |
43 |
6.67±2.09 |
7.78±1.95 |
24(55.81) |
29(67.44) |
37(86.05) |
| 死亡 |
34 |
9.58±2.21* |
10.76±2.18* |
15(44.12) |
15(44.12)* |
32(94.12) |
注：与前一组比较*P＜0.05，与前一组比较**P＜0.01，Ⅰ与Ⅲ组比较△P＜0.05，Ⅰ与Ⅲ组比较△△P＜0.01，▲胞核表达，#胞浆表达 bcl-2在胞浆中表达(图4)，其表达与乳腺肿瘤良恶性有关。不同恶性等级间阳性率差异有显著性(P＜0.01)，随恶性等级增高，阳性率逐渐降低；5年存活组阳性率高于死亡组(P＜0.05)。但不同肿瘤大小、淋巴结转移与否之间阳性率无显著差别。
图4 乳腺癌中bcl-2在胞浆中表达。LSAB×200
c-myc在良性肿瘤中为胞核表达，且多表达在腺管的基底层细胞中(图5)，阳性率达92.31%，而在恶性肿瘤中则以胞浆表达为主，或核、浆均有表达(图6)，胞核阳性率54.55%，胞浆阳性率89.61%。胞浆表达率与肿瘤的恶性等级关系密切，随着恶性等级增高，阳性率显著增高(P＜0.05)，但与肿瘤大小、淋巴结转移和预后无关。
图5 良性乳腺肿瘤中，c-myc以胞核表达为主。LSAB×200
图6 乳腺癌中c-myc在核、浆共表达。LSAB×400
2.3 Rb、bcl-2、c-myc的表达与AI、MI的关系(表2) Rb的表达与AI、MI均关系密切，表达阳性组显著低于阴性组(P＜0.01)；bcl-2阳性组AI显著低于阴性组(P＜0.05)，前者MI也低于后者，但缺乏统计学意义；c-myc表达阳性组AI、MI高于阴性组，但无显著意义。
表2 Rb、bcl-2、c-myc表达与AI、MI的关系
| 项 别 |
n |
AI |
MI |
| Rb(+) |
39 |
6.15±2.17 |
6.82±2.01 |
| (-) |
38 |
10.81±2.03** |
12.95±1.86** |
| bcl-2(+) |
44 |
6.69±2.27 |
8.06±2.15 |
| (-) |
33 |
9.21±2.01* |
10.03±2.00 |
| c-myc(+) |
69 |
8.03±2.24 |
9.56±3.23 |
| (-) |
8 |
6.11±2.41 |
9.00±3.11 |
*P＜0.05，**P＜0.013 讨论
Rb与c-myc的改变是乳腺癌中常见的两种基因异常现象。Rb是细胞周期的负调节因子，是细胞生长、分化调控的中心环节。现已证明Rb是肿瘤抑制基因，在多种恶性肿瘤中都有该基因的突变和蛋白表达异常〔2〕。本实验也证实Rb表达与乳腺肿瘤良恶性有关，而乳腺癌不同大小、不同恶性等级间Rb阳性率差异显著，表明Rb在抑制乳腺癌的生长增殖方面发挥重要作用，但本实验发现Rb与淋巴结转移及乳腺癌的预后无明显相关性。c-myc基因是一个比较特别的基因。它既可促进细胞增殖，也可促进细胞凋亡〔3〕。究竟发挥何种作用与生长因子是否存在有关。生长因子存在时c-myc表达促进细胞增殖，生长因子缺乏时c-myc表达则促进凋亡。本实验未发现c-myc与AI、MI相关，可能与c-myc阴性例数太少(仅8例)而致统计学处理误差太大有关。在良性乳腺组织中c-myc在胞核中表达，阳性率为92.31%，而恶性肿瘤中则大多为胞浆表达或核、浆共同表达，胞浆表达阳性率为89.61%，且随着恶性等级增高，c-myc的阳性率亦明显增高。在Pietilainen等〔4〕的研究中也有类似报道。他们发现，乳腺癌中12%有c-myc胞核表达，其表达与雌激素受体缺乏有关；95%有胞浆表达，该表达与肿瘤等级、有丝分裂指数及转移、预后的关系比较复杂，位于肿瘤中心区的细胞表达和上述指标的关系与侵袭性边缘处不同。乳腺癌中c-myc在胞浆高表达及核浆共同表达的现象，目前尚无满意解释。
研究发现，细胞凋亡和增殖之间存在着密切的关系：(1)从形态上看，凋亡小体的形态与有丝分裂象很相似(图2)，都有染色体浓集和核膜解体的现象〔1〕。(2)在肿瘤组织中观察和计数有丝分裂指数与凋亡指数，发现二者呈显著正相关〔5〕。(3)许多细胞增殖周期的调控基因也参与凋亡的过程，例如p53基因为性激素撤除引起的多种细胞凋亡所必需〔6〕；c-myc既可引起细胞的增殖，也能促进细胞凋亡〔3〕；在凋亡过程中发现了细胞周期依赖性激酶(CDK)的激活〔7〕等。以上事实均证明，细胞凋亡与增殖有关。本文计数了乳腺癌中的AI与MI，也证实细胞凋亡与有丝分裂呈显著的正相关，而且凋亡细胞和核分裂象均在高恶性等级组中较多，反之较少。
对于细胞凋亡与增殖二者以何种机制发生联系，目前尚无统一的结论。细胞凋亡与增殖的正相关性提示凋亡在具有不同生长潜能的亚群的克隆性选择中发挥作用〔5〕。肿瘤细胞发生凋亡可能是受高增殖潜能的克隆亚群诱导，以便后者能获得更好的增殖因素。本实验中AI与MI一样，肿瘤＞2 cm组MI显著高于直径≤2 cm组，随着恶性等级的增高，AI亦显著增高，存活≥5年组AI小于死亡组，而非我们原先预想的AI与MI相反，凋亡细胞越多，肿瘤越小，恶性等级越低，预后越好。这也表明少数肿瘤细胞在自然状态下发生的凋亡是其它肿瘤细胞为获得更好的增殖条件而诱发的，是有利于整个肿瘤快速增长的。bcl-2是细胞凋亡的抑制基因，其表达水平受到性激素的调节。正常情况下激素敏感性上皮细胞如子宫内膜、前列腺、乳腺中有bcl-2蛋白表达〔8〕。本实验中良性乳腺组织92.31%有bcl-2表达，而恶性肿瘤中表达率降至57.14%，表明乳腺癌的发生与bcl-2的下调有关。bcl-2阳性还与恶性等级低、预后好有关，可能是抑制了细胞凋亡，从而阻碍了高增殖潜能的细胞亚群通过诱导细胞凋亡而进行的克隆选择所致。
Wyllie等〔9〕认为，细胞凋亡与细胞进入有丝分裂周期有关。即使是处于G0期的非增殖细胞在发生凋亡前也必须再次进入细胞周期。这一假说在前列腺肿瘤中得到证实〔10〕。在由于种种原因(如生长因子缺乏、激素撤除等)使细胞完成有丝分裂周期的尝试失败之后，细胞才走向凋亡。这一假说可以解释本实验观察到的现象：AI与MI正相关；Rb表达阳性组AI、MI均较阴性组低，而bcl-2仅与AI有关。现已明确，Rb基因是细胞周期G1～S期的一个关卡，它可以抑制细胞进行DNA复制而进入细胞增殖周期〔2〕。按照上述假说，Rb位于有丝分裂上游，凋亡位于下游，故Rb在抑制有丝分裂的同时也间接抑制了凋亡；bcl-2直接为凋亡的负调控基因，与凋亡上游的有丝分裂无关。Philip等〔11〕对体外培养的细胞株及人体组织观察发现，多种上皮及淋巴组织发生凋亡前的确进入了细胞周期，但是，体外培养的成熟中性粒细胞及人体月经期前子宫内膜细胞凋亡前未进入细胞周期。说明并非所有的细胞发生凋亡前都要进入细胞周期。似乎对不同类型的细胞，凋亡与增殖的关系也不同。
最终细胞凋亡与增殖的相互关系如何，是同一肿瘤中的不同细胞亚群为竞争更好的增殖因素而发生的克隆性消除，还是同一细胞有丝分裂受阻而转入凋亡，或者二者兼而有之，还需进一步地动态观察研究。
作者简介：高莉，女，25岁，硕士
詹洲，男，60岁，主任医师，教授，硕士生导师
参考文献
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收稿日期：1998-06-12
修回日期：1999-01-20
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