层粘连蛋白受体和nm23蛋白在乳腺癌组织中的表达及其与间质微血管密度和肿瘤转移的关系

　　中华病理学杂志2000年第29卷第3期

　　李玉林　寇伯君　吴珊　张丽红　朱桂彬

　　摘　要　目的　探讨乳腺癌组织层粘连蛋白（LN）及其受体（LN-R）和 nm23蛋白的表达与间质微血管密度及肿瘤转移的关系。方法　应用免疫组织化学LSAB方法检测73例乳腺癌LN，LN-R和nm23蛋白的表达，在第Ⅷ因子相关抗原（FⅧRAg）染色切片上检测其微血管密度(MVD)。结果　病理分级越高，乳腺癌LN表达程度越强，即病理Ⅰ级而LN分布Ⅲ级者为8.3%,病理和LN分布均Ⅲ级者为58.8%，两者间差异有极显著意义。LN-R表达程度则与转移有关，转移组表达程度（78.6%）高于非转移组（26.7%）。 lN-R的表达程度与乳腺癌间质MVD呈正相关。淋巴结转移率，nm23表达阳性组与阴性组比较差异有显著性意义。在 nm23表达抑制时， LN-R，MVD增加，淋巴结转移明显增加。结论　LN-R表达增强，MVD增加， nm23表达抑制，可能作为预测肿瘤转移及判断预后的可靠指标。

　　关键词：乳腺肿瘤；新生血管化，病理性；受体，层粘连蛋白；肿瘤转移

　　肿瘤血管的生成是肿瘤生长和转移的先决条件。通过已生成的血管，肿瘤细胞可获得呈指数级分裂及侵袭转移的能力^［1，2］。在这一过程中，细胞外粘附分子，特别是层粘连蛋白（LN）及其受体（LN-R）起着重要的作用。层粘连蛋白受体只分布在良性细胞的基底面，而在恶性肿瘤却分布在癌细胞的整个表面，使癌细胞更容易与基底膜粘附，以利于其侵袭和转移。 nm23 mRNA水平与癌转移潜能及淋巴结转移状态呈负相关，所以，恶性肿瘤实质、间质之间的这种决定其侵袭转移能力的特殊表型及其与转移抑制基因 nm23的关系已成为研究的热点。我们利用 73例手术切除的乳腺癌材料，检测LN，LN-R，nm23蛋白在乳腺癌组织中的表达；并在第Ⅷ因子相关抗原(FⅧRAg)染色切片上进行微血管计数，探讨在乳腺癌间质血管生成及其与LN、LN-R、nm23的相互关系，为乳腺癌的治疗和预后判断寻求新的指标。

　　材料和方法

　　收集1995年1月至1998年8月本校各临床学院及吉林省肿瘤医院手术切除乳腺癌标本73例，乳腺良性增生8例。患者术前均未经任何抗癌治疗。依据1981年WHO乳腺癌的分类标准并经数位病理医师确诊为乳腺癌并进行病理分型；依据1957年Bloom和Richardson^［3］提出的方法进行分级。取材经Carnoy液固定，做4 μm连续切片。HE及免疫组织化学染色。

　　免疫组织化学采用 LSAB法。FⅧRAg：单克隆抗体1∶400，DAKO公司；LN-R：单克隆抗体1∶100，北京医科大学病理学系提供；LN(1∶100)和nm23蛋白(即用型)，多克隆抗体为Sigma公司产品。LSAB试剂盒购于DAKO公司。以在肿瘤细胞胞质、胞膜、血管内皮细胞、基底膜出现棕黄色颗粒判定为阳性。LSAB法染色过程中，以 pBS代替一抗作阴性对照。参照文献［4，5］进行微血管计数，在200×视野下观察FⅧRAg染色的切片，单个内皮细胞着色亦作为一个计数单位，不以是否形成血管管腔或管腔内有无红细胞作为计数标准；每例选择4个不重复视野计数，然后计算每例乳腺癌的单位视野（200×视野）平均血管数，即间质微血管密度（microvascular density,MVD)，单位为个／200×，结果进行统计学处理。LN的免疫组织化学染色情况以腺体基底膜线性染色完整性分为3级：Ⅰ级有完整或近乎完整的基底膜围绕每个瘤团；Ⅱ级基底膜不完整，变薄，断裂，缺损或仅见部分包绕瘤团；Ⅲ级基本没有形成基底膜。将LN-R的免疫组织化学染色切片分为3组。即切片中完全无表达或瘤细胞阳性表达率小于10％者为（－）；阳性物质表达率大于10％但仅表达在瘤细胞的基底膜面为（＋）；阳性物质表达占整个细胞膜面的3/4或在大部分胞质中有表达为（2＋）。 nm23蛋白染色的计量方法以阳性染色瘤细胞数大于10％为阳性，小于10％或无阳性着色为阴性。

　　统计学分析根据数据类型分别采用t检验，方差分析和χ²检验。数据均用Spass7.5软件包处理。

　　结果

　　1.LN、LN-R和FⅧRAg及nm23蛋白的表达特点：8例乳腺良性肿瘤组织中LN均表达为连续线状分布于瘤团周围基底膜上，以及末梢导管、增生扩张的小导管外围及间质内残存的小血管基膜处。76.7%（56/73）的乳腺癌组织的瘤团周围见LNⅠ、Ⅱ级阳性表达。在3例导管内癌和2例小叶原位癌组织中LN呈连续线状而比较纤细，偶有断裂的表达（图1）；其余45例浸润性乳腺癌和6例原位癌中呈间断线状、波浪状、缺如或消失（图2）。在8例乳腺良性肿瘤和4例原位癌、17例浸润癌中，LN-R表达于瘤细胞的基底膜面，呈黄褐色颗粒状，细胞质和胞核不着色；在27例浸润癌和7例原位癌中广泛表达，占整个细胞膜的3/4甚至累及胞质（图3），但是FⅧRAg仅在乳腺癌的内皮细胞胞质着色（图4）。nm23蛋白的阳性颗粒分布于乳腺癌瘤细胞胞质内，呈黄褐色（图5）。

　　2.乳腺癌 LN、 LN-R、MVD与各病理因素的关系(表1)：病理分级不同，LN表达程度间差异有显著意义(χ²=25.068, p＜0.001)；Spearman等级相关检验rs′=0.560,P＜0.01,有正相关关系，即病理分级越高，表达程度越强。LN-R表达强度则与转移有关，转移组表达强度高于非转移组(χ²=18.711，P＜0.001)，而其他因素与LN、LN-R表达强度的相关性无显著性意义。MVD在病理Ⅲ级时高于Ⅰ、Ⅱ级， f=4.592，P＜0.05，有淋巴结转移者高于无转移者，(t=6.029,P＜0.001)。而与其他因素间关系无显著性意义。

　　3.nm23蛋白、LN-R与淋巴结转移的关系：nm23蛋白阳性者淋巴结转移率为17.1%（7/41），低于阴性者65.6%（21/32），χ²=17.9,P＜0.001。LN-R(-及+)者转移率为15.4%（6/39）,2+者为64.7%（22/34），两者比较χ²=18.69，P＜0.001。综合分析nm23蛋白与LN-R和淋巴结转移的关系，经组内分组χ²检验，总χ²=24.410，r=3,P＜0.001,因素分解卡方为χ²_nm23蛋白=5.722，r=2, p＞0.05, χ²_LN-R=18.687,r=1,P＜0.001。

　　4.LN、 LN-R、nm23蛋白表达与MVD的比较：由表2可见，LN表达程度与MVD差异无显著意义（F=2.99,P=0.0567）；LN-R表达程度增强，MVD呈增加趋势，F=59.87,P＜0.001；nm23蛋白阴性同时有淋巴结转移者MVD高于无转移者，t=4.517,P＜0.001；而nm23蛋白阳性者，淋巴结有、无转移的MVD间差异无显著意义（t=0.617,P＞0.54)。

　　讨论

　　1.乳腺癌LN及其受体的表达与肿瘤转移的关系及意义：肿瘤细胞穿越基底膜是转移的关键。当瘤细胞合成构成基底膜的物质多于降解时，基底膜结构完整，能延缓瘤细胞的侵袭；反之则基底膜结构缺失，瘤细胞得以生长侵袭^［6，7］。我们发现LN在瘤团周围的表达与肿瘤的病理分级有关，即在分化程度较高的乳腺癌中LN的表达呈连续线状围绕瘤团分布，而在分化程度较低的乳腺癌中LN多呈不连续状，波浪状，缺如或消失。由此可以理解为，分化良好的瘤团基底膜成分的合成多于降解，基底膜得以凝聚形成，可以延缓瘤细胞向间质侵袭；反之，瘤细胞则得以侵袭间质。因此，肿瘤基底膜LN表达的有无、多寡可作为恶性指标之一。而作为基底膜主要成分的LN在促进肿瘤转移的过程中与肿瘤细胞表面受体的作用密不可分。Liotta^［8］认为瘤细胞表面LN-R的多少直接影响LN促进肿瘤转移能力。也有实验表明，人浸润性乳腺癌细胞质膜特异性结合LN的能力较正常或良性乳腺瘤高50倍^［9］。这些恶性肿瘤细胞表面较低度恶性肿瘤细胞有更多的未结合的 lN-R，为恶性肿瘤粘着于基底膜并进一步侵袭转移创造了条件。本实验结果也表明 lN-R在乳腺癌细胞膜上表达的程度与有无淋巴结转移有关。

图1，2　LN在乳腺原位癌(图1)、浸润性乳腺癌(图2)中的表达　×400

图3　LN-R在浸润性乳腺癌中的表达　×400

图4　乳腺癌内皮细胞胞质FⅧRAg阳性表达　×200

图5　nm23蛋白在乳腺癌组织中呈黄褐色颗粒状，分布于瘤细胞胞质内×400(图1～5均为LSAB法)

表1　73例乳腺癌不同病理因素间LN、LN-R表达及间质微血管密度的比较

项目	例数	构成比 　　(%)	LN等级分布(%)			LN-R等级分布(%)		MVD
			Ⅰ	Ⅱ	Ⅲ	(+)	(2+)	±s(个/200×)
年龄(岁)
≥46	37	50.7	24.3	45.9	29.7	27.0	51.4	46.9±11.7
＜46	36	49.3	41.7	41.7	16.7	30.6	41.7	48.8±11.9
肿瘤大小
＞2.5 cm	31	42.5	45.2	32.3	22.6	29.0	41.9	48.2±12.2
≤2.5 cm	42	57.5	26.2	50.0	23.8	28.6	50.0	47.6±11.5
组织分型
浸润性导管癌	47	64.4	36.2	42.6	21.3	23.4	46.8	47.9±13.1
浸润性小叶癌	9	12.3	33.3	44.4	22.2	33.3	55.6	47.4±　6.0
典型髓样癌	3	4.1	0	33.3	66.7	100	0	44.7±　1.2
小叶原位癌	5	6.8	40.0	40.0	20.0	60.0	40.0	45.7±　9.8
导管内癌	9	12.3	33.3	44.4	22.2	11.1	55.6	49.9±12.1
病理分级
Ⅰ	24	32.9	62.5	29.2	8.3*	41.7	37.5	45.0±11.5▲
Ⅱ	32	43.8	25.0	59.4	15.6	18.7	46.9	46.8±10.7
Ⅲ	17	23.3	11.8	29.4	58.8	29.4	58.8	54.8±11.5
淋巴结转移
(+)	28	38.4	25.0	42.9	32.1	10.7	78.6**	56.4±11.2▲▲
(-)	45	61.6	40.0	42.2	17.8	40.0	26.7	42.5±　8.4

　　注：LN，LN-R各因素等级分布经χ²检验：^*χ²=25.068，P＜0.001；^**χ²=18.711，P＜0.001；其余P均≥0.2。微血管密度两组经t检验，多组经F检验，^▲F=4.592，P=0.0134；^▲▲t=6.029，P＜0.001；其余P均＞0.5

表2　LN、LN-R和nm23蛋白表达与淋巴结转移时MVD测定结果的比较

　　2.LN及LN-R与乳腺癌间质微血管形成和肿瘤转移的关系及意义：血管形成是肿瘤生长、侵袭、转移过程的必要条件。在这一过程中，肿瘤细胞表面的具有高亲和力的、相对分子质量为67000的LN-R与基底膜上的LN及血管内皮细胞之间的关系尤为密切。LN在肿瘤的血管生成早期起着关键性的作用。作为一个成熟的血管，内皮细胞与基底膜的LN关系密切^［10］。动物实验表明，移植瘤2 d后可见基底膜LN和Ⅳ型胶原呈强阳性染色，同时内皮细胞和周细胞增殖以及内皮细胞从原发灶迁移^［11］。一些体外实验证实，LN a链上的SIKVAV肽段与内皮细胞的关系密切。Grant等^［12］建立的体内模型系统得出结论：LN的SIKVAV肽段是具有促血管生成活性的，能促进肿瘤的血管化和肿瘤生长。我们在本实验中发现：LN存在于瘤团周围的基底膜和血管周围的基底膜上，瘤团周围的基底膜中的LN表达与肿瘤的病理分级有关，在多数浸润性乳腺癌中LN在瘤团周围呈不连续、缺如、消失表达；在血管周围的基底膜上LN的表达则与肿瘤的病理分级无关。而 lN-R的表达程度与肿瘤的血管密度之间存在明显的正相关关系，与淋巴结转移亦存在显著相关。依据这一实验结果，我们得出结论：在大多数浸润癌中，LN-R主要与血管周围基底膜上的LN特异性的结合而促进血管内皮细胞生长，进而发挥其促进肿瘤血管新生和肿瘤转移的作用。

　　3.转移抑制基因nm23蛋白表达、LN及其受体和间质微血管在肿瘤转移中的作用：nm23是目前研究最热门的转移抑制基因，而且其在乳腺癌中的表达程度与淋巴结转移呈负相关的报道已多次见于国内外杂志。我们对nm23蛋白的表达程度与LN，LN-R，MVD及淋巴结转移的有无进行分析，初步研究表明nm23蛋白的表达与LN-R及MVD之间确有相关性，且LN-R的表达及肿瘤间质血管密度在nm23蛋白失表达条件下与乳腺癌淋巴结转移有明显相关趋势。

　　基金项目：国家自然科学基金资助项目(39870314)

　　作者单位：李玉林（130021长春，白求恩医科大学基础医学基础医学院病理解剖学教研室)

　　寇伯君（130021长春，白求恩医科大学基础医学基础医学院病理解剖学教研室）Email:liyulin@public.cc.jl.cn

　　参考文献

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