端粒酶反义腺病毒载体对乳腺癌细胞MCF-7端粒酶的抑制作用

　　中华病理学杂志2000年第29卷第3期

　　张晓伟　童坦君

　　摘　要　目的　研究端粒酶RNA的反义对人乳腺癌细胞系MCF-7细胞端料酶活性的影响。方法　用重组腺病毒转移并表达端粒酶RNA的反义cDNA，采用基因重组、脂质体共转染法获得端粒酶反义重组病毒，用Southern杂交鉴定病毒的整合功能，用TRAP-银染法检测端粒酶活性。结果　MCF-7细胞是恶性乳腺癌的典型细胞系。与对照组MCF-7、MCF-7-vAd-AAV细胞相比，反义病毒感染后的MCF-7-vAdT-AAV细胞的端粒酶活性明显降低，只扩增出小片段的寡聚核苷酸。结论　端粒酶 rNA的反义cDNA的导入，可以显著抑制乳腺癌细胞的端粒酶活性。

　　关键词：乳腺肿瘤；端粒，末段转移酶；腺病毒，人；基因，抑制，肿瘤

　　端粒酶是由RNA和蛋白质组成的核蛋白，可以自身RNA为模板逆转录合成端区重复序列，使细胞获得永生化和恶性转化^［1，2］。1994年，Kim等^［3］发现90%以上的癌细胞都具有端粒酶活性，而生殖细胞与干细胞等正常细胞则无此酶活性。具有端粒酶活性的肿瘤细胞端区长度恒定，不随细胞分裂而缩短，恶性程度高，提示端粒酶在维持端区长度及肿瘤的恶性程度方面起着重要的作用。目前，人类端粒酶RNA（hTR）已经克隆成功^［4］，这使端粒酶的抗癌研究成为可能。由此，可应用反义RNA技术，通过抑制端粒酶RNA以抑制端粒酶活性，达到基因治疗的目的。我们将端粒酶RNA（hTR）的全长cDNA反向重组至整合型腺病毒载体pAdE1CMVITREXneo^［5］上，感染端粒酶活性较高的人乳腺癌细胞系MCF-7细胞,　观察其对MCF-7细胞端粒酶活性的影响，以便今后进一步探讨端粒酶在肿瘤形成中的作用。

　　材料与方法

　　一、材料

　　1．细胞：293细胞为5型腺病毒（Ad5）E1基因转化的人胚肾细胞系，购自中科院上海细胞生物所。MCF-7细胞由本校病理学系郑杰惠赠。

　　2．质粒：pAdE1CMVITREXneo：整合型腺病毒载体，带有腺病毒左端0～16 mu（其中1.3～9.2 mu的E1区缺失），含AAV的2个ITR及neo基因表达盒（10.36 kb）由本室构建。pGRN83：含人类端粒酶RNA（hTR）的cDNA（3.588 kb），由美国Kevin kaster教授惠赠。pBHG11：去掉包装信号的Ad5基因组质粒（0.5～3.7 mu的E1区缺失和77.5～86.2 mu的E3区缺失，34.304 kb）。

　　3．菌种：HB₁₀₁购自北京华美生物试剂公司。

　　4．主要试剂：细胞培养基为高糖DMEM（GIBCO BRL公司）；胎牛血清购自北京北郊奶牛厂。Lipofectin为GIBCO bRL公司产品；限制性内切酶：MluⅠ、EcoRⅤ、EcoRⅠ、XbaⅠ、SalⅠ、HindⅢ等购自华美公司，Klenow 、CIP 、T4 ligase、Taq酶购自Promega公司。聚合酶链反应（PCR）引物由上海生物技术公司合成。上游（TS）：5′-AATCCGTCGTCGAGCAGC-AGAGAGTT-3′，下游（CX）：5′-CCCTTACCCTTACCCTTACCCTAA-3′。随机引物标记试剂盒购自Promega公司。其他试剂均为国产分析纯试剂。

　　二、方法

　　1．端粒酶RNA（hTR）的反义腺病毒载体的构建^［6］参照图1。

图1　hTR反义载体pAdT的构建示意图

　　2.反义重组腺病毒的获得：同源重组法收获重组病毒。在Lipofectin的介导下，穿梭质粒pAdE1CMVITREXneo、pAdT分别与pBHG11共转染293细胞，5 d后收集细胞，于-70℃冻融3次，直到出现典型的细胞病理变化。扩增病毒，提取病毒核酸，酶切鉴定病毒分别为空载体病毒vAd-AAV与反义重组病毒vAdT-AAV。测定病毒的滴度。

　　3.重组病毒整合功能的鉴定：重组病毒vAd-AAV与vAdT-AAV以100 mOI的感染量分别感染MCF-7细胞，提取MCF-7、MCF-7-vAd-AAV及MCF-7-vAdT-AAV3组细胞的基因组DNA，酶切转膜后，分别以neo、hTR cDNA为探针，用随机引物试剂盒（方法参照说明书），Southern杂交法^［6］鉴定病毒的整合功能。

　　4.端粒酶活性测定^［3］：采用TRAP-银染法，待测细胞长至80%～90%汇合时，用0.25%胰酶消化，PBS缓冲液洗2遍，4℃离心,沉淀重悬于1 ml预冷的洗涤液TRAP-1中。离心后弃上清，加40 μl冷裂解液TRAP-2,于0℃裂解30 min，13 500 r/ min，4℃离心30 min, 取上清液用Bradford法进行蛋白定量。端粒酶活性测定：反应体系含：20.0 mmol/L Tris-HCl，pH 8.3，1.5 mmol/L MgCl₂, 63.0 mmol/L KCl, 0.005% tween-20, 1.0 mmol/L乙二醇二乙醚二氨四乙酸（EGTA）, 50.0 μmol/L dNTP, 0.1 mg/ml牛血清蛋白（ BSA）, Taq酶5 U, TS(上游)引物0.1 μg,端粒酶6 μg,30℃,反应2 h。90℃灭活端粒酶活性。加CX（下游）引物0.1μg,混匀后覆盖石蜡油，进行PCR循环：94 ℃ 30 s，50℃ 30 s, 72℃90 s, 共30个循环。将25 μl PCR产物于12%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，当溴酚蓝迁移至凝胶4/5距离时，停止电泳。将凝胶置于固定液（10.0%乙醇，0.5%乙酸）3 min，在固定液里加AgNO₃至终浓度0.2%,染色5 min。弃固定液，蒸馏水漂洗2次：1次20 s,1次2 min。再加400 ml显色液(3% NaOH, 0.5%甲醛)轻轻晃动,直至显色。然后加固定液固定5 min，蒸馏水漂洗10 min。将胶置于干净玻璃板上照相。

　　结果

　　1.hTR的反义腺病毒载体pAdT的构建（图1）：图2为hTR反义腺病毒载体pAdT的酶切鉴定电泳结果。提取质粒DNA并用EcoRⅠ酶切后，重组子可产生长度为0.6 kb、3.9 kb、6.4 kb的3条带，而空载体产生的条带为0.6 kb、3.3 kb、6.4 kb（见图2左）,说明hTR cDNA已插入到pAdE1CMVITREXneo载体。将该重组子分别用HindⅢ、SalⅠ酶切后，0.8%琼脂糖凝胶电泳，产生长度为8.6 kb、2.4 kb的2条带（见图2右），说明hTR cDNA 反向插入到pAdE1CMVITREXneo中，从而获得hTR的反义腺病毒载体pAdT。

　　2．反义重组病毒的获得：重组病毒感染后293细胞出现典型的病理变化：细胞变圆、变大，有空泡形成，并见细胞脱落。提取病毒核酸，用限制性内切酶XbaⅠ酶切后，产生长度为3.2 kb和3.8 kb的2条DNA条带（图3），说明这2种病毒分别为vAd-AAV和vAdT-AAV。测得这2种病毒的滴度分别为7.8×10⁸ pfu/ml与 6.2×10⁸ pfu/ml。

　　M：λDNA/Hind

　　Ⅲ标记物；1：

　　vAd-AAV基因

　　组用Xba Ⅰ酶

　　切；2：vAdT-

　　AAV基因组用

　　XbaⅠ酶切

　　图3　重组病

　　毒核酸酶切鉴

　　定结果

1：MCF-7；2：MCF-7-vAd-AAV；3：MCF-7-vAdT-AAV图4　以neo为探针鉴定病毒的整合功能的Southern杂交结果

1～3：用XbaⅠ酶切；4～6：用Hind Ⅲ+PstⅠ酶切；1，6：MCF-7；2，5：MCF-7-vAd-AAV；3，4：MCF-7-vAdT-AAV图5　以hTR cDNA为探针鉴定病毒整合功能的Southern杂交结果

M：λDNA/Hind Ⅲ标记物；1：pAdE₁CMVITREXneo用EcoRⅠ酶切后；2：pAdT用EcoRⅠ酶切后；3：pAdT用HindⅢ+Sal Ⅰ酶切后图2　pAdT的酶切鉴定电泳结果

　　3．重组病毒整合功能的鉴定： MCF-7感染重组病毒后，分别以neo、hTR cDNA为探针，Southern blot鉴定病毒的整合功能。以neo基因为探针的Southern杂交结果见图4，MCF-7-vAd-AAV细胞和MCF-7-vAdT-AAV细胞分别在3.2 kb、3.8 kb处有杂交条带（XbaⅠ酶切），说明neo基因整合到细胞基因组上。为了进一步确定重组病毒的整合，又以hTRcDNA为探针进行Southern杂交分析（图5），除了内源性hTR基因片段

M：pGEM-7Zf(+)/HaeⅢ标记物；1：MCF-7；2：MCF-7-vAd-AAV；3：MCF-7-vAdT-AAV图6　端粒酶活性的TRAP-银染法检测结果

　　以外，MCF-7-vAdT-AAV细胞分别在3.8 kb处有杂交条带（以XbaⅠ酶切），在3.0 kb处有杂交条带（以HindⅢ、PstⅠ酶切），而对照组MCF-7细胞及MCF-7-vAd-AAV都没有特异的杂交条带。说明外源基因neo、hTR cDNA都已完整地整合到细胞基因组上。

　　4．端粒酶活性测定：如图6所示，MCF-7、MCF-7-vAd-AAV细胞扩增出多个相差6 bp的寡聚核苷酸，呈梯形排列，MCF-7-vAdT-AAV细胞只能扩增出小片段的寡聚核苷酸，说明hTR反义cDNA的导入，抑制了MCF-7细胞的端粒酶活性，使它逆转录合成(TTAGGG)n寡聚核苷酸的能力下降。

　　讨论

　　基因治疗最关键的问题是载体问题，高效病毒载体的开拓，将是基因治疗能付诸临床应用的重要保证。我们构建的整合型腺病毒载体pAdE1 cMVITREXneo是在腺病毒载体pAdE1CMV^［7］的基础上，插入腺病毒相关病毒（AAV）的2个反转重复序列(ITRs)及新霉素抗性基因(neo)。因此，它集腺病毒和AAV病毒的优点，具有转导效率高、整合稳定、高效表达外源基因等功能。

　　1995年Singer等人分离并克隆了Hela细胞的端粒酶RNA，命名为hTR。我们^［8］将hTR全长cDNA反向重组至整合型腺病毒载体pAdE1 cMVITREXneo，构建了hTR全长反义载体pAdT，与pBHG11共转染293细胞后获得的反义重组腺病毒vAdT-AAV，感染MCF-7细胞，能够将hTR cDNA整合至细胞基因组上，从而稳定持久地抑制端粒酶RNA，使细胞的端粒酶活性下降。并且细胞端区长度缩短，细胞的恶性度下降。

　　端粒酶是大多数肿瘤细胞持续分裂所必需的，因此，抑制端粒酶活性也许能够成为治疗肿瘤的新方法，它可能比目前所使用的化学疗法和基因疗法具有更大的优势。

　　基金项目：国家自然科学基金资助课题(39930170)和国家重点基础研究发展规划(G1999053906)资助课题作者单位：张晓伟(100083北京医科大学生化与分子生物学系)

　　童坦君(100083 北京医科大学生化与分子生物学系)

　　通信作者：童坦君（Email:biochem@mail.bjmu.edu.cn)

　　参考文献

　　1　Autexier C, Greider CW. Functional reconstitution of wild-type and mutant Tetrahymena telomerase. Genes Dev, 1994, 8: 563-575.

　　2　Mattei D, Scherf A. Subtelomeric chromosome instability in Plasmodium falciparum: short telomere-like sequence motifs found frequently at healed chromosome breakpoints. Mutat Res, 1994, 324:115-120.

　　3　Kim NW, Piatyszek MA, Prowse KR, et al. Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer. Science, 1994,266:2011-2015.

　　4　Feng J, Funk WD, Wang SS, et al. The RNA component of human telomerase. science, 1995, 269:1236-1241.

　　5　王福山, 张晓伟, 童坦君.定点整合型基因治疗腺病毒载体的构建. 北京医科大学学报，1997,29:295-298.

　　6　萨姆布鲁克 J,弗里奇 GF，曼尼阿蒂斯 T，著.分子克隆实验指南.金冬雁，黎孟枫译.第二版，北京: 科学出版社，1989. 16-56.

　　7　张晓伟，王福山，童坦君. 绿色荧光蛋白cDNA在腺病毒重组载体转染中的应用.生物化学与生物物理进展, 1998, 25: 266-268.

　　8　张晓伟，廖海妮,童坦君. 端粒酶RNA的反义cDNA对乳腺癌细胞端区长度的影响.生物化学与生物物理学报, 1999, 31: 527-530.